白藜蘆醇抑制嗜水氣單胞菌毒力作用研究

譚宏亮 陳 凱 習丙文 秦 婷 潘良坤 謝 駿

(1. 南京農業大學無錫漁業學院, 無錫 214081; 2. 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心,農業部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室, 無錫 214081)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種在淡水生態環境中廣布的革蘭氏陰性菌, 普遍存在于自然界水體、土壤和水生動物體表及消化道內[1],在特定條件下可引起水生動物局部或全身感染, 尤其在漁業生產中每年都會造成養殖鯉(Cyprinus carpio)、鯽(Carassius auratus)、團頭魴(Megalobrama amblycephala)、斑點叉尾鮰(Ietalurus punetaus)和羅非魚(Oreochromisspp.)等養殖品種暴發出血性敗血病, 是淡水養殖中影響較大的條件性致病菌[2,3]。基于大量病原生物學研究發現嗜水氣單胞菌的菌毛(Pilus)、外膜蛋白(Outer membrane protein, OMP)、溶血素(Hemolysin)、氣溶素(Aerolysin)、生物膜(Biofilm)等在病原菌株的黏附、入侵、定植、毒素分泌、宿主營養奪取和增殖等致病過程中發揮重要作用[4—7]。同時, 病原菌能通過群體感應(Quorum sensing, QS)調控系統協同細胞群體生長、毒力和抗逆性等[8,9]。當前, 在水產養殖中抗生素、化學藥物、疫苗和微生物制劑等被廣泛應用于防控嗜水氣單胞菌引起的細菌出血病; 然而,抗生素仍然是最主要的防控手段。隨著病原菌耐藥性、水環境污染和食品安全等問題日益受到國家和公眾的廣泛關注, 水產細菌病防控迫切需要探索研發新的防治策略和藥物。

中草藥應用于臨床防控人、畜和水生動物疾病已有幾千年的歷史。近年, 中草藥藥理學研究快速推動中草藥資源的開發和利用。藥用植物提取物中的多糖、生物堿、酸、萜類、皂苷和黃酮類等具有重要的殺蟲、抑菌、抗炎和抗氧化等作用。白藜蘆醇(Resveratrol, Res)是一種天然單體化合物, 存在于藥用植物大黃(Rheum palmatum)、虎杖(Reynoutria japonica)和藜蘆(Veratrum nigrum)等,具有抗菌、抗炎和抗氧化等功效[10—12], 能夠抑制細菌病原泳動、群體感應、生物膜形成、鞭毛基因表達和溶血活性[12—17]等。

本研究通過體外試驗分析白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌生長和毒力相關基因表達的影響, 并通過人工感染試驗檢測白藜蘆醇對感染嗜水氣單胞菌異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)的保護作用和對魚體炎癥相關因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株和培養條件

本實驗所使用的嗜水氣單胞菌株NJ-35由南京農業大學劉永杰教授實驗室饋贈。菌株保存在-80℃甘油管中, 使用前在NB平板劃線, 28℃過夜培養, 挑取單克隆。

1.2 藥品和試劑

白藜蘆醇(99%)購自aladdin、二甲基亞砜(DMSO)購自碧云天公司、NB培養基購自青島海博生物技術有限公司、無菌脫纖維綿羊血購自南京森貝伽生物科技有限公司。基因轉錄表達分析試劑: RNAiso Plus, One Step SYBR?PrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit (TaKaRa)等均購自大連寶生物有限公司。

1.3 白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌生長的影響

將白藜蘆醇溶解于DMSO配置成母液, 稀釋備用。取嗜水氣單胞菌NJ-35單菌落于NB液體培養基(蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉3 g/L、氯化鈉5 g/L)中過夜培養(28℃, 180 r/min), 離心(3000 r/min, 5min)后棄上清, 用無菌生理鹽水調整細菌A600=0.3。菌液按(1%v/v)接種量轉接至含白藜蘆醇(濃度分別為1024、512、256、128、64、32和16 μg/mL)的NB培養基中; 設置培養基內不添加白藜蘆醇的空白對照組和添加等量DMSO的溶劑對照組; 控溫搖床中(28℃、180 r/min)培養26h, 每2h取樣檢測A600值。試驗設置3個重復, 根據取平均值繪制生長曲線。

1.4 白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌生物膜形成的影響

根據Vasudevan等[18]的結晶紫染色法檢測菌株生物膜。菌液按(1%v/v)接種量轉接至含有白藜蘆醇(濃度分別為128、64、32 和16 μg/mL)的NB培養基中, 設置空白對照組和DMSO溶劑對照組。在充分混勻后, 轉入至96孔細胞培養板中, 28℃靜置培養48h后, 吸出菌液并測定細胞濃度, 同時用無菌PBS清洗培養孔后, 先后用100 μL 40%甲醛固定15min, 1%結晶紫溶液染色5min; 干燥后加入100 μL 33%冰醋酸, 37℃ 孵育30min溶解結晶紫。用全波長酶標儀(Multiskan G, Thermo Scientific)測定培養孔中溶液的A590值, 試驗重復3次, 各試驗組設置3個重復。由于不同試驗組細菌生長存在差異, 每個樣品孔測得的A590值需要消除由細菌濃度造成的差異;生物膜A590(相對值)=A590(測量值)/A600(細菌濃度值)。

1.5 白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌溶血活性的影響

根據Mao等[19]的試驗方法檢測嗜水氣單胞菌NJ-35溶血活性。菌液按(1%v/v)接種量轉接至含有白藜蘆醇(濃度分別為128、64、32和16 μg/mL)的NB培養基中, 設置培養基內不接種嗜水氣單胞菌的空白對照組和不添加白藜蘆醇的陽性對照組。搖床培養(28℃、180 r/min)8—16h, 調整各組A600值到1.0, 用過濾膜(0.22 μm)過濾除細菌細胞。將綿羊紅細胞用PBS稀釋成5%懸浮液, 37℃水浴30min。取50 μL細菌過濾液加入5 mL紅細胞懸液中, 37℃靜止孵育30min, 室溫下5000 r/min離心10min。取上清液測定A405值, 試驗重復3次, 各試驗組設置3個重復。用此公式計算溶血百分比: H%=(AS-A0)/(A100-A0)(AS: 添加藥物組A405值,A0: 空白對照組A405值,A100: 陽性對照組A405值)。

1.6 白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌毒力相關基因表達的影響

用無菌生理鹽水調整細菌A600=0.3, 菌液按(1%v/v)接種量轉接至含白藜蘆醇(濃度為64 μg/mL)的NB培養基中過夜培養, 對照組接入不含白藜蘆醇的NB培養基中; 5000 r/min離心1min, 棄上清, 根據RNAiso Plus試劑盒的操作說明, 提取細菌總RNA; 使用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific,Wilmington, DE, USA)測定樣品RNA濃度并調整濃度至40 ng/μL, 凍存于-80℃備用。以嗜水氣單胞菌rpob作為內參基因, 檢測細菌溶血素基因hly, 外膜蛋白基因omp, 群感系統相關基因luxR、luxS、qseb表達量的變化。樣品RNA反轉錄和熒光定量分析溶液配制參照One Step SYBR?PrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit (Takara)試劑盒的方法和步驟。熒光定量分析檢測采用ABI PRISM 7500 Real-time PCR Systeam儀器, 基因相對表達量分析用2-ΔΔCt方法; 試驗所用引物見表 1。

1.7 白藜蘆醇對異育銀鯽的保護作用

異育銀鯽[(50±10) g; (10±1.5) cm]由中國水產科學研究院淡水漁業研究中心南泉實驗基地提供,在室內循環水養殖系統中馴化2周, 水溫26℃。將試驗魚隨機分為4組, 每組設3個重復, 每個重復30尾。在用病原菌嗜水氣單胞菌攻毒前1h, 每組分別注射白藜蘆醇(藥物∶魚體重: 0、25、50和100 mg/kg)。病原菌接種于無菌NB培養基中, 28℃、180 r/min培養18h, 離心收集細胞, 用無菌PBS調整濃度接近半致死量1×106CFU/mL, 每尾魚腹腔注射100 μL菌液, 攻毒后連續觀察7d, 記錄死亡量。7d后每組隨機采取21尾魚的肝臟和血清(3500 r/min, 15min)保存于-80℃備用。根據RNAiso Plus試劑盒的操作方法, 對肝臟樣品的總RNA進行提取, 使用Nano-Drop 2000測定RNA的濃度后用Nuclear-free water調整濃度至40 ng/μL, 且A260/A280值在1.8—2.0,凍存于-80℃冰箱備用。β-actin作為內參基因, 根據實時熒光定量RT-PCR試劑盒使用說明在ABI PRISM 7500 Real-time PCR Systeam儀器中檢測免疫相關基因TNF-αmRNA、IFN-γmRNA、IL-10 mRNA表達量變化, 數據分析用2-ΔΔCt方法, 試驗所用引物見表 2。

表 1 熒光定量PCR所用引物Tab. 1 Primers used for quantitative PCR

1.8 數據統計分析

試驗數據結果以平均值±標準誤(Mean±SEM)表示, 其中毒力因子mRNA表達量數據使用SPSS 19.0統計軟件中的獨立樣本T檢驗法比較分析; 其他數據使用軟件中的單因素方差分析(One-way ANOVA)進行檢驗, 使用Duncan氏法進行組間多重比較,P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 白藜蘆醇抑制嗜水氣單胞菌生長

如圖 1所示, 空白對照組和溶劑DMSO試驗組生長曲線基本重合, 溶劑DMSO不影響嗜水氣單胞菌NJ-35的生長。白藜蘆醇濃度≤32 μg/mL時對NJ-35的生長沒有明顯的影響(P＞0.5), 在白藜蘆醇濃度≥64 μg/mL時, 明顯抑制了嗜水氣單胞菌的生長, 菌株進入對數生長期的時間出現了延遲, 且生長平臺期菌液濃度明顯低于對照組(P＜0.5)。隨著白藜蘆醇濃度增加, 嗜水氣單胞菌進入對數生長期的時間也隨之延遲, 且穩定期的最大值也隨之降低。白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)明顯高于1024 μg/mL。

2.2 白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌生物膜形成的影響

如圖 2所示, 溶劑DMSO對嗜水氣單胞菌NJ-35生物膜形成無顯著影響(P＞0.5), 白藜蘆醇濃度為16 μg/mL時, 對NJ-35生物膜形成抑制率為2.5%, 與對照組相比無顯著差異(P＞0.5), 在白藜蘆醇濃度為32 μg/mL時, 生物膜形成抑制率為12.4%, 與對照組相比有顯著差異(P＜0.5)。在白藜蘆醇濃度為64和128 μg/mL時, NJ-35生物膜抑制率分別為40.5%和44.6%, 差異顯著(P＜0.5)。

2.3 白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌溶血活性的影響

如表 3所示, 溶劑DMSO試驗組溶血率為98%,對嗜水氣單胞菌NJ-35溶血無明顯影響(P＞0.5); 白藜蘆醇濃度為16 μg/mL時, 溶血率為94.8%, 抑制溶血效果不顯著(P＞0.5); 當白藜蘆醇濃度為32 μg/mL時, 溶血率為78.8%, 能顯著抑制NJ-35溶血活性(P＜0.5)。白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌NJ-35溶血活性的抑制作用呈現劑量依賴, 白藜蘆醇濃度越高抑制效果越強。

表 2 熒光定量PCR所用引物Tab. 2 Primers used for quantitative PCR

2.4 白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌毒力相關基因表達的影響

如圖 3所示, 菌株接種到含64 μg/mL白藜蘆醇的培養基后, 嗜水氣單胞菌NJ-35毒力相關基因表達呈現不同的變化趨勢。Ⅰ型群感系統相關基因luxR表達量顯著上調(P＜0.5), Ⅱ型群感系統相關基因luxS、外膜蛋白omp表達量顯著下調(P＜0.5), 其中溶血素hly、Ⅲ型群感系統相關基因qseb下調不顯著(P＞0.5)。

2.5 白藜蘆醇對感染嗜水氣單胞菌的異育銀鯽死亡率的影響

如圖 4所示, 異育銀鯽攻毒后7d累計死亡率, 試驗中對照組7d累計死亡率超過50%, 腹腔注射白藜蘆醇的處理組死亡率低于對照組, 其中注射濃度為25 mg/kg組的7d累計死亡率為29.1%, 50 mg/kg組7d累計死亡率為20.8%, 100 mg/kg組累計死亡率最低為12.5%。試驗表明腹腔注射白藜蘆醇可降低異育銀鯽的死亡率。

2.6 白藜蘆醇對感染嗜水氣單胞菌的異育銀鯽肝臟基因表達量的影響

如圖 5所示, 異育銀鯽注射病原菌后肝臟組織中炎癥因子TNF-α、IFN-γ mRNA表達量顯著上調(P＜0.5), 白藜蘆醇處理組TNF-α mRNA和IFN-γ mRNA的表達量顯著下調(P＜0.5); 其中TNF-α mRNA表達量在注射濃度為50 mg/kg白藜蘆醇時達到最低; IFN-γ mRNA表達量在注射濃度為100 mg/kg白藜蘆醇時達到最低。而抑制炎癥因子IL-10 mRNA表達量在注射嗜水氣單胞菌NJ-35后顯著降低, IL-10 mRNA表達量在注射濃度為50 mg/kg白藜蘆醇時達到最低。

3 討論

3.1 白藜蘆醇對病原菌的最小抑菌濃度

白藜蘆醇是一種天然多酚, 存在于多種植物中,具有廣譜抗菌作用(Anti-bacterial activity); 能顯著抑制多種致病菌的生長、泳動、毒力和生物膜形成等[20]。本研究首次報道了白藜蘆醇對水生動物重要細菌病原嗜水氣單胞菌的抗菌作用。在此前的研究中, 白藜蘆醇對不同來源細菌菌株的最小抑菌濃度存在較大差異。如He等[21]發現白藜蘆醇對具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)的MIC值為100 μg/mL。Jung等[22]在對43株人畜來源細菌的藥敏試驗分析發現, 白藜蘆醇對其中40株菌的MIC≥1000 μg/mL。本研究發現白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌的MIC值與后者研究結果相似(≥1000 μg/mL)。由于1000 μg/mL接近白藜蘆醇在溶劑中的最大溶解濃度, 因此, 后續研究主要關注白藜蘆醇在低濃度條件下對嗜水氣單胞菌的抗菌作用。

表 3 白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌溶血活性的影響Tab. 3 The effect of resveratrol on the hemolytic activity Aeromonas hydrophila

圖 1 嗜水氣單胞菌NJ-35在不同濃度的白藜蘆醇培養基中生長曲線Fig. 1 The effect of resveratrol on the growth of Aeromonas hydrophila NJ-35

圖 2 白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌NJ-35生物膜形成的影響Fig. 2 The effect of resveratrol on the biofil formation of Aeromonas hydrophila NJ-351. 對照組control; 2. DMSO; 3. 16 μg/mL; 4. 32 μg/mL; 5. 64 μg/mL;6. 128 μg/mL

圖 3 白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌NJ-35毒力相關基因轉錄表達的影響Fig. 3 Effect of resveratrol on the virulence gene expression in Aeromonas hydrophila NJ-351. luxR; 2. luxS; 3. Hly; 4. Qseb; 5. Omp; 柱形圖的上標“*”表示差異顯著mean significant difference, P＜0.05

3.2 白藜蘆醇影響病原菌群感調控系統基因表達

嗜水氣單胞菌具有復雜的群感調控系統(如Ⅰ型LuxR/I, Ⅱ型LuxS/AI-2和QseBC), 能根據菌體周圍環境中信號分子, 協同調控細胞群體的生長、運動性、毒力表達和生物膜生成等, 在病原菌致病過程中發揮重要作用[23—28]。研究表明嗜水氣單胞菌ahyⅠ基因缺失, 顯著降低影響Ⅰ型群感調控系統信號分子AHL表達, 菌株致病性顯著下降[29]。王娜[25]研究發現嗜水氣單胞菌luxS基因缺失株在生物膜形成能力、黏附能力與溶血活性都出現減弱, 相關基因的表達量下調。同時, 張小軍等[30]研究發現嗜水氣單胞菌luxS缺失株不產生Ⅱ型群感系統的信號分子AI-2, 并影響AHLs合成; 說明群感調控系統間具有一定交互調控作用。Ⅲ型群感系統(Qse-BC雙組分調控系統)廣泛存在于革蘭氏陰性桿菌中, 參與細菌的毒力、鞭毛和生物膜的形成。本研究發現64 μg/mL白藜蘆醇處理嗜水氣單胞菌后, 其群感調控系統中luxR基因顯著上調表達,luxS基因顯著下調表達, 但QseB基因無顯著變化。這說明白藜蘆醇可以影響嗜水氣單胞菌Ⅰ型和Ⅱ型群感調控系統基因表達。

3.3 白藜蘆醇影響病原菌生物膜生成和毒力因子活性

圖 4 嗜水氣單胞菌攻毒后異育銀鯽累計死亡率Fig. 4 Cumulative mortality rate (%) of crucian carp after Aeromonas hydrophila challenge in 7 days

圖 5 肝臟組織炎癥因子轉錄表達變化Fig. 5 The effect of resveratrol on the expression of Liver tissue inflammatory factors柱形圖上不同字母表示有顯著差異, P＜0.05Different letters indicate significant differences, P＜0.05

生物膜作為細菌一種十分重要的胞外結構, 參與細菌黏附、物質運輸以及自我保護等功能。本研究發現白藜蘆醇(32—128 μg/mL)能顯著抑制嗜水氣單胞菌生物膜形成。白藜蘆醇對霍亂弧菌(Vibrio cholera)抑菌作用研究表明其可以通過與病原菌轉錄調控因子AphB相結合, 從而在不抑菌的情況下減弱細菌形成生物膜的能力[15]。白藜蘆醇濃度≥32 μg/mL時, 嗜水氣單胞菌的溶血活性顯著降低, 但溶血素基因hly的表達量并沒有明顯的變化。嗜水氣單胞菌能夠分泌多種與溶血活性相關的毒力因子, 其中屬于溶血性毒素[25]的氣溶素和溶血素是最重要的致病因子[32]。它們主要通過作用于細胞膜磷脂結構與活性從而破壞細胞膜[25,33]或作為細胞膜孔蛋白導致大量離子涌入引起滲透失衡使細胞死亡[34]。有研究認為氣溶素基因aer和絲氨酸蛋白酶基因ahpA是嗜水氣單胞菌具有致病力的關鍵基因, 而溶血素hly與嗜水氣單胞菌的致病力并不相關[5], 但也有研究者提出致病性嗜水氣單胞菌必定存在aer或hly基因[35], 同時存在aer和hly兩個基因時為強毒株[36]。嗜水氣單胞菌的溶血活性可能通過多個基因共同發揮作用。菌體外膜蛋白是嗜水氣單胞菌黏附宿主細胞主要作用因子和重要的免疫抗原[37,38]。白藜蘆醇(64 μg/mL)處理嗜水氣單胞菌后omp基因表達量下調, 說明嗜水氣單胞菌受白藜蘆醇的影響黏附能力減弱。在實驗過程中, 作者發現白藜蘆醇與嗜水氣單胞菌胞外產物直接共同孵育, 并不能直接改變胞外產物的溶血活性(數據未發表)。因此, 白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌溶血活性和生物膜形成的影響可能通過調控群感因子表達進而影響下游毒力相關因子。

3.4 白藜蘆醇促進魚體抗病原菌感染力

研究表明白藜蘆醇腹腔注射大鼠(20 mg/kg)1h后, 在心、肝、腎、腸等組織中都能檢測到白藜蘆醇, 且肝臟濃度最高, 達到6.72 μg/mL[39], 因此, 本研究采用白藜蘆醇腹腔注射濃度為20—100 mg/kg。攻毒試驗結果表明白藜蘆醇對感染嗜水氣單胞菌的異育銀鯽有顯著保護作用, 藥物處理組死亡率都低于對照組。白藜蘆醇對異育銀鯽的保護作用可能從兩方面發揮作用, 一方面魚體組織分布的白藜蘆醇能減弱病原菌的毒力, 另一方面白藜蘆醇能降低魚體自身炎癥反應。白藜蘆醇在人和其他動物體內被發現具有很好的抗炎癥作用。適度的機體炎癥反應對抑制病原具有重要作用, 但長期過高的炎癥因子表達, 會損傷魚體甚至導致死亡[31]。Yu等[40]研究顯示, 大黃魚(Larimichthys crocea)高死亡率組脾臟組織中往往具有更高的促炎癥因子表達量, 這或許意味著炎癥因子表達量和死亡率也存在一定關系。TNF-α和IFN-γ都是促炎癥因子, 參與動物體內的免疫調節, TNF-α被認為是炎癥因子中的核心因子, 當發生病原體感染時, 炎癥細胞被激活后會釋放大量如TNF-α等的炎癥介質, 而且較嚴重的組織中往往會有更高的TNF-α蛋白表達量和TNF-αmRNA表達量[41]。楊智景等[42]在對鰻弧菌(Vibrio anguillarum)感染香魚(Plecoglossus altivelis)的研究中發現血清和巨噬細胞中TNF-αmRNA表達量和TNF-α蛋白表達量同步上升。本研究中白藜蘆醇處理組促炎癥因子TNF-αmRNA和IFN-γmRNA表達量顯著下調, 表明白藜蘆醇可以減弱因病原菌感染而導致的炎癥反應, 從而減輕因炎癥而導致的魚體損傷。Zhang等[43]研究證明白藜蘆醇可以通過抑制NF-κB信號通路中p65和IκB的磷酸化以及MAPK信號通路中p38和ERK的磷酸化, 降低LPS誘導引起的促炎性細胞因子的表達。Zheng等[44]研究發現飼料添加白藜蘆醇(0.1 g/kg)能上調吉富羅非魚肝臟組織中IL-10 mRNA等抗炎因子的表達量, 降低促炎癥因子TNF-α和IFN-γmRNA的表達。

綜上所述, 白藜蘆醇≥32 μg/mL時, 對嗜水氣單胞菌致病力具有顯著抑制作用, 對受嗜水氣單胞菌感染的異育銀鯽有明顯保護作用。白藜蘆醇在預防和治療水生動物由嗜水氣單胞菌引起的細菌敗血癥具有重要的應用價值。