二維薄層色譜法分析分枝桿菌脂質成分

石耀林,王丙云,畢利軍,陳 鑫,黃雯晶,陳 勇

(佛山科學技術學院生物科學與工程學院,廣東 佛山 528225)

牛結核病(Bovine Tuberculosis)是由牛型結核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)引起的一種人獸共患慢性傳染病,我國將其列為二類動物疫病,接種疫苗是控制牛結核病的手段之一,目前為止卡介苗(BCG)是臨床上唯一應用的抗牛結核病疫苗,但BCG的疫苗效果不均一性的問題引起研究者關注,因此尋找新型有效的疫苗尤為重要[1-3]。

現階段新型牛結核病疫苗較多研究重組BCG疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗和蛋白亞單位疫苗,而對分枝桿菌脂質成分疫苗的研究尚不多,隨著耐多藥結核(MDR)及廣泛耐藥結核(XDR)的發現,所以需要研發具有更安全有效的保護作用的新型牛結核疫苗應用于臨床。結核菌是一種細胞壁富集脂類的細菌,其抗原性參與到結核免疫應答,這里我們利用有機溶劑萃取結核菌細胞壁脂類[4],并通過薄層色譜法[5]探討BCG和恥垢分枝桿菌細胞壁脂類成分差異,從而為研發新型牛結核疫苗提供新的方向,為分枝桿菌脂質成分疫苗研究提供可能[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 BCG-pasteur菌株(實驗室保存);mc2155菌株(實驗室保存)。

1.1.2 儀器 薄層色譜展開缸(100 mm×200 mm),購自上海信誼儀器有限公司;層析板(100 mm×200 mm),購自青島海洋有限公司。

1.1.3 主要試劑 石油醚,氯仿,甲醇,丙酮,均為分析純試劑購,自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.4 培養基 Middbrook7H9液體培養基、Middbrook7H10固體培養基、增菌液OADC,均購自美國BD公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種制備 將BCG-pasteur和mc2155菌株分別接種50 mL Middbrook7H9培養基,BCG-pasteur菌株培養1周,而 mc2155菌株培養到0.8～1.0OD后收集菌液,121℃滅活20 min,4 000 r/min離心10 min后棄上清,用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline,PBS)洗2次,收集菌體。

1.2.2 脂質的萃取 旋轉蒸發烘干菌體,稱取100 mg干重的菌體[7]。先加入2 mL甲醇：0.3%NaCl(100∶10)溶液和1 mL石油醚到離心管,混勻20 min。3 500 r/min離心5 min后將上層液體移去新的離心管A,接著再加入1 mL石油醚再次混勻20 min萃取。再將上層液體移去離心管A,兩次上層液體合并,用氮氣干燥,析出非極性脂質[8]。

1.2.3 二維薄層色譜法 左下角離板1 cm x 1 cm的距離涂點等量的脂質,標記方向1與方向2,風機下干燥樣品[9]。根據溶劑體系加入展開劑(如表1所示),按照方向1擺放底部,當溶劑的前端滲透薄層板頂部,拿出風干薄層板;加入新的展開劑換方向2[10],溶劑滲透頂部拿出風干,用5%乙醇磷鉬酸染色,100℃燒灼薄層板15 min,掃描儀下掃描薄層。

1.2.4 圖片陰影相對值采用Imagej工具計算,脂質陰影值用Mean表示。展開劑系統A-D見表1。

表1 2D-TLC分析脂質的展開劑系統

2 結果與分析

2.1 2 D-TLC展開劑系統A分析比較 展開劑系統A下,可分離出三酰甘油和甲硫酚二角酰亞胺兩種脂質成分,經分析,BCG-pasteur中三酰甘油TAG的Mean值為72.724,甲硫酚二角酰亞胺PDIM的Mean值為55.991;mc2155中三酰甘油TAG的Mean值為50.176,甲硫酚二角酰亞胺PDIM的Mean值為49.594,含量均比BCG-pasteur的低。見圖1。

2.2 2 D-TLC展開劑系統B分析比較 展開劑系統B下,可分離出家族蛋白PAT、甘油二酯、游離脂肪酸和游離分枝菌酸,經分析,BCG-pasteur中家族蛋白PAT的Mean值為36.79,甘油二酯DAG的Mean值為76.293;mc2155中家族蛋白PAT的Mean值為29.736,甘油二酯DAG的Mean值為25.142,含量均比BCG-pasteur的低。見圖2。

圖1 展開劑系統A下BCG-pasteur與mc2155菌株脂質成分以及含量比較

圖2 展開劑系統B下BCG-pasteur與mc2155菌株脂質成分以及含量比較

2.3 2 D-TLC展開劑系統C分析比較 展開劑系統C下,可更細分出游離脂肪酸與游離分枝菌酸,經分析,BCG-pasteur中游離脂肪酸 FREE FATTY ACID的Mean值為86.676,游離分枝菌酸 FREE MYCOLIC ACID的Mean值為83.11;mc2155中游離脂肪酸FREE FATTY ACID的Mean值為15.445,游離分枝菌酸 FREE MYCOLIC ACID的Mean值為64.645,含量均比BCG-pasteur的低。展開劑系統C展開下的脂質含量與系統B的相對應,因此該萃取方法以及展開劑系統具有重復性。見圖3。

圖3 展開劑系統C下BCG-pasteur與mc2155菌株脂質成分以及含量比較

2.4 2 D-TLC展開劑系統D分析比較 展開劑系統D下,可分離出硫脂I類、硫脂III類和葡萄糖單霉菌酸酯,薄層色譜法結果顯示mc2155不含有硫脂I類。Imagej計算得出 BCG-pasteur中硫脂 III類SL-III的Mean值為19.281,海藻糖二霉菌酸酯TDM的Mean值為60.371;mc2155中硫脂III類SL-III的Mean值為5.118,海藻糖二霉菌酸酯TDM的Mean值為4.314,含量均比BCG-pasteur的低。見圖4。

圖4 展開劑系統D下BCG-pasteur與mc2155菌株脂質成分以及含量比較

3 討論

本試驗主要是為了研究結核分枝桿菌的脂質成分的不同,為新型牛結核疫苗和佐劑的研發提供基礎,由于脂質成分不溶于水但能被乙醚、石油醚、氯仿、苯等有機溶劑抽提出,本研究中根據其特性萃取方法進行了優化,其中乙醚溶解脂肪的能力強,應用最多,但現在對于乙醚安全管制嚴格,而石油醚溶解脂肪的能力僅比乙醚弱些,且來源方便,且含水分比乙醚少,沒有乙醚易燃故在萃取脂質方法中將選取石油醚有機溶劑作為萃取試劑,同時,石油醚在研究用途上主要用作溶劑和油脂處理,石油醚本身屬于無色透明液體,在萃取離心后,能有效分層,提高分辨率[11]。

二維薄層色譜法操作是首先在一個方向將混合物進行色譜分離,將紙干燥后,再將混合物用另一種溶劑在與第一個方向的垂直方向進行第二次色譜分離,使用不同溶劑進行雙向展開,相對于單向薄層色譜,二維薄層色譜法的分離效率大大提高,且重復性更穩定[12]。由于TAG與PDIM極性較小,故展開劑系統A選用石油醚∶乙酸乙酯系統和石油醚∶丙酮系統;同理,在系統B中DAG等脂質的極性相對較小,故展開劑也使用石油醚∶丙酮系統;而游離脂肪酸與游離分枝菌酸極性較前兩系統的大,為了更有效的展開成分,故在第一個方向的展開劑的選擇上選取氯仿∶甲醇系統;另外,由于兩次展開都在同一塊薄層板上進行,倘若第一維展開劑中含水,則干燥過程將十分耗時,且很難控制薄層板的含水量,故建議將含水較多的展開劑放在第二維,以確保方法的重現性,因此在展開劑系統D中含水量較多的氯仿：丙酮∶甲醇∶水系統將放在第二維。

本試驗通過建立的萃取方法分離了分枝桿菌的非極性脂質以及通過二維薄層色譜法分析脂質成分,其中可能包括為三酰甘油(Triacylglycerols,TAG)、甲硫酚二角酰亞胺(Phthiocerol dimycocerosates,PDIM)、家族蛋白PAT(Perilipin adipophilinTIP47)、甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)、游離脂肪酸(FREE FATTY ACID,FFA)、游離分枝菌酸(FREE MYCOLIC ACID,FMA)、硫脂 I類(Sulphatides-I,SL-I)、硫脂 III類(Sulphatides-III,SL-III)、葡萄糖單霉菌酸酯(Glucose esters single mold,GMM)、海藻糖二霉菌酸酯(Trehalose esters double mold,TDM)。

根據BCG-pasteur以及mc2155薄層色譜法結果,本試驗建立的萃取方法以及展開劑系統具有可重復性,能準確萃取以及分析分枝桿菌中的非極性脂質成分,研究結果顯示,mc2155細菌中含有脂質成分占比明顯低于BCG-pasteur的細胞壁脂質成分。恥垢分枝桿菌屬革蘭陽性腐生菌,具有快速生長特點,且無致病性,有研究表明,恥垢分枝桿菌與結核分枝桿菌基因高度同源、細胞結構相似等特點[13],這由于兩者的基因雖高度同源,但其仍具有差異之處,這在一定程度上影響了各脂質部分的含量以及組成,另外研究發現,細胞壁脂類與潛在的結核病的發病機制和宿主防御過程具有關聯性,而兩者脂質成分的差異以及含量不同與此觀點相呼應[14]。本試驗結果可見不同分枝桿菌脂類存在較大的差異,通過我們的試驗可以找到具有保護作用的脂質成分,能夠以恥垢分枝桿菌為疫苗載體表達其結核分枝桿菌或者卡介苗中抗原特異性脂類成分,從而提高其免疫原性,可能為一種新的牛結核疫苗研究提供思路,同時這些差異較大的脂質成分也可以作為新的免疫佐劑用以提高卡介苗的免疫保護效果。