奶牛場環境中氣載金黃色葡萄球菌的耐藥性分析與散播試驗

白燕雨,劉家祺,熊云梅,段晉偉,郭 耀,喬婷婷,唐 芳,霍乃蕊,古少鵬

(山西農業大學動物科技學院,山西 太谷 030801)

金黃色葡萄球菌(S.aureus)對人和牛等多種動物均具有易感性,致病性強,分布廣泛,對外界環境抵抗力強[1],并可形成微生物氣溶膠廣泛散布于養殖場內外環境空氣中[2],是奶牛養殖過程中的主要致病菌之一。養殖環境中致病菌的廣泛分布與散播,不僅影響圈舍內動物的健康,同時也給養殖場工作人員和周邊居民帶來威脅,引起嚴重的公共衛生問題[3]。隨著抗生素被廣泛用于治療由金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病,導致耐藥菌株和多重耐藥菌株的出現[4],加劇了該病的防治難度。

研究表明,豬場中S.aureus可通過微生物氣溶膠傳播[5],雞糞中的S.aureus可通過微生物氣溶膠散播于雞場環境和場外下風向中[6];段會勇[7]等的檢測顯示,兔舍中的S.aureus可長時間停留在舍內空氣中,借助氣流等外界因素傳播到舍外一定距離,并可通過呼吸道進入人畜體內引起發病。

本試驗從奶牛場內、外環境以及牛場糞土中分離、鑒定S.aureus,通過耐藥性監測和ERIC-PCR技術,分析牛場內、外環境中金黃色葡萄球菌耐藥情況和氣載S.aureus的散播特點,以期為牛場環境控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 奶牛場基本概況 奶牛場周圍為農田,場內建有圈舍、擠奶間、運動場、飼料間、員工休息區;圈舍為半開放式雙排結構,飼養密度為50頭/棟;圈舍內自然通風,建有糞尿收集坑道;每日06：00～08：00、18：00～20：00擠奶兩次,全天自由采食飲水;圈舍每日定時打掃和投放飼料。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及處理 糞土(Dungsoil)樣本：采集奶牛運動場中多處混合糞土,以1∶9的比例用無菌生理鹽水稀釋,搖床中充分震蕩混勻,吸取100 μL均勻涂布于5%綿羊血瓊脂平板,37℃恒溫培養18～24 h。

牛場內、外環境空氣樣本：使用Andersen-6級標準空氣微生物采樣器采集空氣樣本,采集基質為5%綿羊血瓊脂平板,分別于牛舍內(Inform)、牛場外上風向10 m處(Upwind 10 m)、下風向10 m、50 m、100 m處各選取3個采樣點,每次3 min,每點3個重復。

1.3.2S.aureus的分離純化 挑取血平板上符合S.aureus生長特性的疑似菌落,革蘭染色鏡檢,將革蘭陽性球菌,接種到BP培養基進行選擇純化培養,選取BP培養基上黑色周圍有灰白色圈的菌落在營養肉湯中增菌培養[8]。

1.3.3 DNA的提取和PCR鑒定 使用細菌基因組提取試劑盒提取菌落DNA,利用16S rRNA分析技術[9]對S.aureus進行分子鑒定。金黃色葡萄球菌ATCC25923作為陽性對照菌株,白色葡萄球菌(26101-19)作為陰性對照。

參考文獻[10]設計引物,引物序列為：P1：5′-GCGGTCGCCTCCTAAAAG-3′ P2： 5′-TCCCGGTCCTCTCGTACTA-3′

擴增反應體系為25 μL：2 ×EasyTaqPCR Super-Mix 12.5 μL,去離子水 10 μL,DNA 模板 1.5 μL(100 ng/μL),上下游引物各0.5 μL。反應條件為：94℃預變性4 min,94℃變性30 s,57.5℃退火40 s,72℃延伸40 s,共35個循環,72℃延伸10 min,4℃ 保存[10]。取10 μl的PCR擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統拍照后分析結果。

1.3.4 藥敏試驗 選擇12種臨床常用抗生素對分離鑒定的S.aureus菌株采用紙片擴散法進行藥敏試驗,試驗操作及判定參照美國CLSI抗菌藥物敏感性試驗執行標準。

1.3.5 ERIC-PCR指紋圖譜分析 參考文[11]獻設計 ERIC-PCR 引物,引物序列為：ERIC-1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′ERIC-2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′

擴增反應體系同1.3.3。反應條件為：94℃預變性5 min,90℃變性30 s,52.5℃退火60 s,72℃延伸60 s,共32個循環,72℃延伸10 min,4℃保存[11]。取10 μL的PCR擴增產物進行1.8%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統拍照。對ERIC-PCR指紋圖譜進行處理,標記產物條帶并生成矩陣圖,構建遺傳關系進化樹圖。將每個菌株對應的圖譜作為一個分類學單位,認為遺傳相似系數≥90%的菌株來源相同[12]。

2 結果與分析

2.1S.aureus的分離鑒定結果 經分離純化培養和革蘭染色鏡檢粗篩出株疑S.aureus71株。通過16S rRNA保守序列分析技術對疑似菌進行PCR分子鑒定,擴增的目的片段為450 bp左右,檢測出51株陽性菌株含有與標準S.aureus標準株相同的目的片段,確定為S.aureus,其中在糞便樣本中檢出16株,牛舍空氣樣本中檢出21株,牛場外下風向10 m、50 m和100 m處分別檢出6株、4株和4株,在牛場上風向空氣樣本中未檢測出S.aureus。見圖1。

2.2 藥敏試驗結果 所有分離的S.aureus對P-G的耐藥情況最為嚴重,耐藥率為100%,其次是SXT、STR、TOB、RIF、TET,耐藥率分別為 64.7%、45.1%、33.3%、29.4%、23.5%。其中糞土、牛場內、場外下風空氣中S.aureus對SXT的耐藥率分別為100%、57.14%、35.71%,對STR的耐藥率分別為56.2%、42.9%、35.7%,對TOB的耐藥率分別為37.5%、33.3%、28.57%,對RIF的耐藥率分別為43.75%、28.57%、14.28%,對TET的耐藥率分別為37.5%、19.05%、14.29%,對CFP的耐藥率分別為25%、9.52%、7.1%,對GEN的耐藥率分別為18.75%、9.52%、14.28%,對NOR的耐藥率分別為31.25%、9.52%、7.14%,對 ERY的耐藥率分別為 0、0、14.28%,對Ni的耐藥率分別為6.25%、0、42.85%,見表1。

圖1 S.aureus PCR鑒定結果

表1 S.aureus藥敏結果

對51株S.aureus的多重耐藥分析發現：檢測菌株的多重耐藥率為76.5%(39/51),多重耐藥種數主要集中在2耐～7耐之間,有2株菌對8種以上抗生素耐藥,見圖2。

圖2 S.aureus多重耐藥結果

2.3S.aureus的ERIC-PCR指紋圖譜分析 ERICPCR擴增得到S.aureusDNA指紋圖譜,應用NTSYS-pc2.10分析軟件構建遺傳關系進化圖,得到各菌株之間的遺傳相似系數。被測菌株在遺傳相似度上整體被分為兩大分支,其中牛舍空氣和運動場糞土中分離的21株S.aureus中有19株菌遺傳相似系數≥90%;牛場外下風向與牛場糞土和牛舍空氣中有7株菌遺傳相似系數≥90%,見圖3。

圖3 采樣點分離株聚類分析圖

3 討論

3.1 牛場環境中S.aureus的危害S.aureus是重要的環境致病菌,是引起牛急性、慢性乳房炎的主要病原,并可通過空氣侵染人和動物呼吸系統引起氣管炎、肺炎,化膿性炎癥[1]。本研究在同一時間段從牛舍空氣、牛場糞土和牛場外環境樣本中分離出71株疑似S.aureus,經16S rRNA保守序列分析技術鑒定出51株S.aureus,檢出率分別為70%(21/30)、88.9%(16/18)、58.3%(14/24)。 根據 Andersen-6級空氣收集器的采樣特點,后期我們分析發現,分離得到的S.aureus大約70%可進入人和牛體肺泡,對牛和養殖人員造成很大的潛在威脅。其中牛場糞土中的S.aureus分離率明顯高于牛舍和牛場外空氣,所以在實際養殖過程中要及時清除牛舍和運動場的糞便,重視牛舍環境空氣消毒。上風向采樣點中未分離出S.aureus,這可能與上風向S.aureus濃度較低有關,而且風向、溫度等外界環境因子也會影響S.aureus的存活力[3],這與鐘召兵[6]等人在雞場的上風向10 m、50 m處均未檢出S.aureus的結果一致;在牛場下風向50 m、100 m處均檢出S.aureus,提示S.aureus可隨氣流在一定范圍內散播[2],所以在牛養殖場選址上應該盡量遠離居民區、生活水源等。在奶牛場糞土和牛舍空氣中都檢測到大量的S.aureus,這不能排除牛場其他生產環節中存在S.aureus的可能性,在奶牛養殖過程中,這部分S.aureus可通過破損的表皮黏膜、毛囊、消化系統及呼吸系統侵入動物機體,引起局部化膿感染,甚至敗血癥,還可污染奶源,經食物鏈引起人的食源性感染[1]。

3.2S.aureus的耐藥性 該牛場環境中的S.aureus多重耐藥現象嚴重,對P-G均耐藥,對SXT、STR、TOB、RIF、TET有不同程度的耐藥,流行病學調查顯示,S.aureus耐藥譜與牛場臨床用藥基本相符,故在臨床治療中應根據藥敏試驗結果選取抗生素。糞土、牛舍、牛場外下風空氣中S.aureus對ERY的耐藥率分別為0、0、14.28%,牛舍內未檢出對ERY耐藥的S.aureus,但在場外下風向中檢出2株對ERY耐藥的S.aureus,提示該菌株可能來源于養殖場周圍環境;場外下風向中耐NiS.aureus的檢出率明顯高于糞土和場內空氣中,說明部分S.aureus可能來源于養殖場周圍環境。牛場下風向與牛場糞土和牛舍空氣分離的S.aureus耐藥譜有一定程度的一致性,提示這部分S.aureus是通過牛場微生物氣溶膠隨空氣向周邊環境散播的。

3.3S.aureus親緣性分析 對S.aureus遺傳相似系數比較分析發現,牛舍空氣中90.5%(19/21)、牛場外空氣中50%(7/14)的S.aureus與糞土中的S.aureus遺傳相似系數≥90%,表明奶牛養殖場內、外環境空氣中的S.aureus主要來源于糞土,該結論也在S.aureus耐藥性中得到。糞土中的S.aureus可經過一定的理化過程進入空氣,形成微生物氣溶膠散布于牛舍中,并借助氣流等外力的影響散播到養殖場下風向空氣中。牛舍空氣中有9.5%(2/21)的S.aureus與糞土中的S.aureus遺傳相似系數≤85%,提示這部分的菌株可能來源于牛體或帶菌的養殖人員;牛場外空氣中50%(7/14)的S.aureus與糞土中的S.aureus遺傳相似系數≤85%,提示養殖場外環境空氣體中的S.aureus部分來源于牛場,也有部分來源于周邊外環境。