黃芩湯對小鼠感染大腸桿菌血液細胞、生化指標及促炎因子的影響

王 新,段佳燚,徐錦濤,楊 婧,叢 霞,秦志華,郭 沛,單 虎

(青島農業大學動物醫學院,山東 青島 266109)

產腸毒素大腸桿菌(ETEC)K88是引起新生和斷奶仔豬腹瀉的主要致病菌之一[1-2],能夠導致仔豬血液白細胞數量增多,多種促炎性細胞因子的生成。由于抗生素的濫用導致大腸桿菌的耐藥性不斷的增強,獸藥殘留情況也越來越嚴重。中國的中藥資源豐富、且具有毒副作用小和無耐藥性等優點[3-4]。黃芩湯的主要作用是清熱止痢,和中止痛,對于機體免疫力有一定的提高。本試驗與探討黃芩湯對于防治小鼠感染大腸桿菌K88的效果,旨在為臨床應用黃芩湯防治仔豬大腸桿菌性腹瀉提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 酶聯免疫檢測試劑盒(48T)-購自南京建成生物工程研究所;內毒素檢測鱟試劑盒-購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司;黃芩湯由黃芩、芍藥、炙甘草和大棗組成,購自山東省青島市城陽人民醫院,按照《中華人民共和國藥典》[5]中記載的煎煮方法,稱取所需中藥,均用分體式電子智能保健煲煎煮兩次。第一次先加入8倍的水將藥材浸泡30 min,加熱煎煮1 h。第二次加入4倍的水,加熱0.5 h,去除藥渣保留藥液,將兩次煎煮所得全部藥液用3層紗布過濾后,取上清液用旋轉蒸發儀濃縮至1 g/mL的中藥原液,高壓滅菌后4℃保存備用;0.1 g/mL氟苯尼考溶液,購自天津市諾維動物藥業有限公司。大腸桿菌K88由青島農業大學動物醫學院臨床診斷學實驗室惠贈。SPF級昆明系小鼠,體重18～22 g,雌雄各半,購自山東省濟南市朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.2 試驗方法 預防試驗：選取健康且體重相近昆明系小鼠80只,隨機分為黃芩湯組、氟苯尼考組、對照組、空白對照組,每組20只,雌雄各半。黃芩湯組及氟苯尼考組小鼠攻毒之前連續給藥5 d,并分別灌服1 mL黃芩湯(濃度1 g/mL)、1%氟苯尼考溶液1 mL,對照組和空白對照組灌服等量的生理鹽水。黃芩湯組、氟苯尼考組和對照組分別于最后一次給藥3 h后腹腔注射0.1 mL大腸桿菌K88菌液(5×107CFU/mL),空白對照組注射等量的生理鹽水。

治療試驗：選取健康且體重相近昆明系小鼠80只,按照預防試驗的分組,每組20只,雌雄各半。黃芩湯組、氟苯尼考組和對照組分別于第一次給藥前3 h,腹腔注射0.1 mL大腸桿菌 K88菌液(5×107CFU/mL),空白對照組注射等量的生理鹽水。攻毒3 h后黃芩湯組灌服濃度1 mL黃芩湯(濃度1 g/mL),氟苯尼考組灌服1%氟苯尼考溶液1 mL,對照組、空白對照組灌服等量的生理鹽水。

1.3 測定指標 記錄統計攻毒后48 h內各組的死亡數以及死亡率;檢測小鼠白細胞、紅細胞、血小板等血常規指標;使用血清參照鱟試劑盒和酶聯免疫檢測試劑盒說明書進行含量測定。

1.4 數據處理 數據采用SPSS22.0統計軟件中ANOVA(One way analysis of variance)法,用 Duncan法進行均值的多重比較。結果用±s表示。

2 結果與分析

2.1 小鼠死亡數和死亡率的動態變化 由表1可知,注射了大腸桿菌的對照組死亡率為80%,說明了大腸桿菌毒力很強。治療試驗組的死亡率接近氟苯尼考組,說明了黃芩湯對大腸桿菌病的治療效果較佳。

表1 治療試驗各組小鼠死亡數和死亡率的動態變化(n=20)

2.2 小鼠血液中細菌 LPS、TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量變化 由表2可知,黃芩湯組小鼠血清中LPS、TNF-α、IL-1β的含量與對照組差異極顯著(P＜0.01);且TNF-α的含量與氟苯尼考組差異極顯著(P＜0.01)。黃芩湯組小鼠血清中IL-6的含量與對照組差異顯著(P＜0.05)。

表2 預防試驗各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和LPS含量

由表3可知,黃芩湯組小鼠血清中LPS的含量與氟苯尼考治療組差異極顯著(P＜0.01)。黃芩湯組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量與對照組差異極顯著(P＜0.01)。

2.3 黃芩湯對感染大腸桿菌K88小鼠血常規指標的影響 由表4可知,對照組與空白對照組相比,白細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞、嗜堿性粒細胞的數目均有極顯著性(P＜0.01)增高;紅細胞數目、血紅蛋白濃度、紅細胞壓積有極顯著性(P＜0.01)降低;血小板各項指標均差異不顯著(P＞0.05)。黃芩湯組中,白細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞數目極顯著(P＜0.01)低于對照組,紅細胞數目、血紅蛋白濃度、紅細胞壓積與空白對照組相比均有顯著性(P＜0.05)降低。

表3 治療試驗各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和內毒素含量

表4 預防試驗血常規檢驗結果

由表5可知,對照組與空白對照組相比白細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞、嗜堿性粒細胞的數目均有極顯著性(P＜0.01)增高;紅細胞數目、血紅蛋白濃度、紅細胞壓積、平均紅細胞血紅蛋白濃度均有極顯著性(P＜0.01)降低;血小板各項指標均差異不顯著(P＞0.05)。黃芩湯組中,白細胞、嗜中性粒細胞數目極顯著(P＜0.01)低于對照組。紅細胞數目、平均紅細胞血紅蛋白濃度與平均紅細胞血紅蛋白濃度均顯著(P＜0.05)高于對照組。

表5 治療試驗血常規檢驗結果

3 討論

3.1 黃芩湯對小鼠死亡率的影響 試驗檢測結果發現,使用大腸桿菌攻毒后能引起小鼠70% ～80%死亡,通過對比發現,黃芩湯對小鼠感染大腸桿菌K88有顯著的預防及治療作用。嚴梅楨等[6]死亡保護法進行體內抗菌試驗,發現黃芩湯代謝產物對分別由金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染引起的偽無菌小鼠死亡有明顯保護作用,與試驗結果一致。

3.2 黃芩湯對血液中 LPS、TNF-α、IL-1 β 和 IL-6含量的影響 大腸桿菌K88主要以菌毛、腸毒素和細菌崩解后產生的內毒素發揮致病作用[7]。LPS在細菌死亡崩解時大量釋放并且進入循環血液,造成內毒素血癥[8]。通過試驗結果對比發現,在治療試驗中,氟苯尼考組小鼠的血清中LPS含量顯著升高,原因可能是氟苯尼考在殺滅大腸桿菌的同時,造成大腸桿菌大量崩解,釋放出大量LPS有關,徐能武[9]、劉嵐[10]、王紅芳[11]的試驗都證明,抗生素在殺滅細菌的同時能促進LPS的釋放。TNF-α能夠促進IL-1 β和IL-6的分泌,在發生炎癥和細胞凋亡的過程中具有重要意義[12]。黃芩湯能顯著降低小鼠血清中的LPS、IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,說明黃芩湯能降低大腸桿菌感染小鼠后的炎癥反應。該結果與王怡薇[13]等人的研究結果一致。

3.3 黃芩湯對小鼠血常規指標的影響 當發生細菌性感染時血液中單核細胞、淋巴細胞和嗜中性粒細胞明顯升高,活化的白細胞能分泌產生TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細胞因子并相互作用。通過試驗結果對比發現,黃芩湯能顯著降低受大腸桿菌感染的小鼠血液中白細胞、提高小鼠血液中的紅細胞,對小鼠感染大腸桿菌后體內免疫產生調節作用,改善小鼠的貧血現象。李樂天[14]的試驗證明,白芍能抑制炎癥反應中白細胞、淋巴細胞和嗜中性粒細胞的活化與增殖,并能顯著提高經LPS誘導的炎癥小鼠紅細胞數和血紅蛋白,說明白芍可抵抗炎癥性貧血。

4 結論

黃芩湯對感染大腸桿菌K88小鼠有極顯著的防治作用。黃芩湯的主要通過降低血液中的內毒素及炎性因子的含量,進而降低機體炎癥反應水平,發揮保護作用。