貴州土雞中 ALV-J、REV和 MDV的混合感染

林漢卿,溫貴蘭,汪德生,張升波,徐 麗,李昌紅

(1.貴州大學動物科學學院,貴州 貴陽 550025;2.貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室,貴州 貴陽 550025)

禽白血病、網狀內皮組織增生癥和馬立克病是禽類最為常見的3種腫瘤病,可導致家禽出現嚴重的免疫抑制,繼發感染其他疾病,對養禽業危害巨大。出現混合感染時,疾病的致病力和致腫瘤能力都遠大于單一感染,導致的免疫抑制也更為嚴重。禽白血病由禽C型反轉錄病毒科的禽白血病病毒(ALV)引起,根據病毒囊膜糖蛋白gp85抗原性的差異,ALV可分為A～J 10個亞群,J亞型禽白血病病毒(ALV-J)是最近較為流行的外源性病毒,可引起雞的骨髓細胞瘤。禽網狀內皮組織增生癥病毒是RE的病原,主要引起雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉等產生急性網狀細胞增生、矮小綜合征及免疫器官萎縮。根據與單克隆抗體反應的差異,將REV分為I、II和III型3種不同亞型,我國目前流行的REV以III型為主。雞馬立克病(MD)的特征是淋巴組織增生性紊亂,病原為雞馬立克病病毒(MDV)。依據其生物學特性可將MDV分成3個血清型,其中只有血清1型MDV(MDV-1)具有致病力。Witter等人[1]依據毒株毒力的不同,將 MDV-1進一步分為溫和毒(mMDV)、強毒(vMDV)、超強毒(vvMDV)及特超強毒(vv+MDV)。MDV的致瘤相關基因有meq基因、pp38基因、vTR基因等,其中meq基因為MDV-1特有[2]。MDV的毒力和致瘤能力都有逐漸增強的趨勢,對疫苗的抵抗力也在增加。近年來,各個地區陸續出現兩種或3種腫瘤病混合感染的報道,腫瘤病發展得越來越復雜,防控難度也在增大。2017年8月,貴州省某土雞養殖場發生了一起以步態不穩、歪脖、雞冠腫瘤為特征的傳染性疾病,經病理剖檢、PCR鑒定和序列分析,判定該雞場存在禽白血病、網狀內皮組織增生癥和馬立克病的混合感染。

1 材料與方法

1.1 材料 病毒材料為貴州省某雞場送檢的土雞組織病料,大腸埃希菌DH5α,購自碧云天生物技術公司;2 ×EsTaqMaster Mix、pMD-18T、連接酶 Solution I、DL-2 000 Marker,購自寶生物工程(大連)有限公司;HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒,購自康為世紀生物科技有限公司,RNA提取試劑盒,購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司,瓊脂糖凝膠回收試劑盒,購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 方法

1.2.1 流行病學調查 詢問養殖戶雞群信息,觀察送檢病雞的臨床表現,仔細檢查病雞皮膚有無異常。在無菌條件下解剖病雞,觀察病理變化并記錄。

1.2.2 引物設計 參照GenBank數據庫中登錄的ALV-J原型毒株 HPRS-103(GenBank登錄號：Z46390)的gp85基因序列、MDV美國毒株 RBIB(GenBank登錄號：AY243332.1)的meq基因序列和REV的SNV株(GenBank登錄號：DQ003591)的env基因序列,用Primer Premier 5.0軟件分別設計3對特異性引物。引物的堿基序列見表1,引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.3 PCR鑒定 按常規方法提取病雞組織RNA并反轉錄,用設計的3對引物分別對所得cDNA進行PCR擴增,反應體系為：cDNA 2 μL,2×Es TaqMaster Mix 12.5 μL,上下游引物各 1 μL,ddH2O 8.5 μL,反應程序如下：95℃預變性4 min;94℃變性30 s,58℃退火1 min,72℃延伸1 min,共33個循環;72℃再延伸10 min。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 目的基因的克隆與序列測定 PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,利用膠回收純化試劑盒分別純化回收PCR產物,用Solution I連接酶將3個純化產物與pMD-18T載體16℃連接過夜,并轉化至大腸埃希菌DH5α感受態細胞中。菌液在含氨芐的固體培養基上培養12 h后,挑取單個菌落純培養,取2 μL菌液為模板進行PCR擴增及電泳檢測,將鑒定結果為陽性的菌液送至廣州立菲生物公司測序。

2 結果與分析

2.1 流行病學調查結果 送檢雞場每天的死亡數為10多只,雞群免疫過禽流感疫苗和新城疫疫苗,未免疫馬立克病疫苗,雞群發病后使用過很多抗菌藥物,均無明顯效果。送檢雞為130日齡左右,病雞出現呼吸困難、站立不穩、歪脖等現象(見中插彩版圖1),肉髯腫瘤結節(見中插彩版圖2),剖檢可見心臟、脾臟(見中插彩版圖3)、腸系膜等處有明顯的腫瘤結節。肝臟有明顯出血點,腎臟、脾臟明顯腫大,腺胃、肌胃和氣管有不同程度的出血。

圖1 病雞出現歪脖現象

圖2 肉髯腫瘤結節

圖3 脾臟灰白色結節

2.2 ALV-Jgp85基因PCR擴增結果及序列分析

gp85基因擴增產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴增出約921 bp的特異性條帶,與預期條帶一致?？寺『笏统鰷y序,將所得序列命名為GZ2017-ALV。用DNAStar7.1生物學軟件比對,核苷酸同源性分析顯示,GZ2017-ALV跟J亞型毒株HuB09JY04、GZD17的核苷酸同源性最高,都為99.3%,與J亞型原型毒株NXO1O1的同源性為96.7%,與其他亞型的同源性僅有45.3% ～47.2%。遺傳進化樹顯示(圖4),GZ2017-ALV與J亞型毒株GX13LT02親緣關系最近,與其他J亞型毒株都處于同一大分支,與A、B、D、E亞型毒株均處于不同分支。

圖4 ALV gp85基因核苷酸序列的遺傳進化樹分析

2.3 REVenv基因PCR擴增結果及序列分析REVenv基因經擴增后,出現約615 bp的特異性條帶,與預期條帶一致。克隆后送出測序,得到618 bp大小的堿基序列,編碼206個氨基酸,將其命名為GZ2017-REV。與GenBank上傳的 REV分離株進行比對,GZ2017-REV與分離株CY1111和2012001-2的核苷酸同源性最高,為95.1%,與Ⅲ型代表株CSV的核苷酸同源性也相對較高,為94.5%,與Ⅰ型代表株170A的核苷酸同源性為92.1%,與Ⅱ型代表株SNV的核苷酸同源性則相對較低,為90.7%。遺傳進化樹結果顯示(圖5),GZ2017-REV與2012001-2處于同一小分支,與CSV和170A處于同一大分支,SNV則與HQSC2024和GD1210在另一分支。

圖5 REV env基因核苷酸序列的遺傳進化樹分析

2.4 MDVmeq基因PCR擴增結果及序列分析MDVmeq基因經擴增后,出現與預期條帶一致的約522 bp的特異性條帶?？寺『鬁y序得到522 bp大小的序列,編碼174個氨基酸,命名為 GZ2017-MDV。將其與GeneBank上的16株分離株比對分析,核苷酸同源性高達98.5% ～99.6%。與美國vvMDV代表株RBIB的核苷酸同源性為98.9%,與vv+MDV代表株N的核苷酸同源性則為99.4%(圖6)。

3 討論

禽白血病、網狀內皮組織增生癥和馬立克病是目前危害我國養雞業最嚴重的3類腫瘤病,隨著病毒的進化,3種腫瘤病之間的混合感染越發嚴重,病毒間相互的協同作用使得病毒更難以控制。近幾年來,各地相繼出現了雞傳染性貧血病病毒、傳染性腔上囊病病毒等與ALV、REV、MDV的混合感染[3-5],但貴州省還未見ALV、REV、MDV混合感染的報道。根據病理變化、PCR鑒定和序列分析結果,可判定貴州省某雞場發生了 ALV-J、REV和 MDV的混合感染。

ALV-J于2000年首次在中國分離到,宿主范圍廣泛、進化迅速,目前已成為最為流行的禽白血病病毒亞型。gp85基因作為決定亞群特異性的主要蛋白,在ALV-J的進化和變異中起到了至關重要的作用[6]。分析顯示,A～E亞群相互間的gp85基因的同源性大于80%,而J亞群與其他亞型間gp85基因的同源性只有40%左右,因此常選用gp85基因來鑒別ALV-J[7]。本試驗測序得到的GZ2017-ALV的gp85基因跟GenBank中J亞型ALV標準毒株的gp85基因同源性為96.7% ～99.3%,與其他亞型的同源性僅有45.3% ～47.2%,說明流行株GZ2017-ALV是J亞型禽白血病病毒。REV作為一種反轉錄病毒,不僅能整合到宿主的基因組中垂直傳播給下一代,還能整合到MDV基因組中引起復雜的混合感染[8],因此難以根除,目前尚無有效的防控辦法。根據與單克隆抗體反應的差異,REV可分為3型,I、II、III型的代表株分別為 170A、SNV、CSV,我國內地的REV流行株以III型為主[9],也有部分為I型,II型REV鮮有報道。流行株GZ2017-REV與170A、SNV、CSV的核苷酸同源性分別為92.1%、90.7%和94.5%,遺傳進化樹表明其與170A、CSV的親緣關系相對較近,說明GZ2017-REV很可能是目前較為流行的III型REV。MD不僅是一種腫瘤病,還能侵害動物的神經。本試驗的病雞出現頭頸歪斜很可能是控制頸肌的神經受害引起的,呼吸困難可能是由于迷走神經受到侵害,而步態不穩則是由于坐骨神經受侵害,這也是MD的典型癥狀。meq基因作為公認的致腫瘤相關基因,與MDV的毒力有一定關聯,且保守性較強,是近年的研究熱點[10-11]。對病雞的meq基因進行克隆和序列分析,結果表明,流行株GZ2017-MDV與各分離株的核苷酸同源性為98.5% ～99.6%,與vv+MDV代表株N的核苷酸同源性高達99.4%,說明GZ2017-MDV是特超強毒株的可能性比較大。

目前AL和RE都沒有有效疫苗,市面上雖有MD疫苗,但MDV毒力的不斷增強,以及ALV和REV兩種病毒對動物機體的侵害,使得疫苗的免疫效果減弱,常出現免疫失敗。要阻止腫瘤疾病的傳播,種群凈化必不可少。