雞傳染性支氣管炎病毒感染無特定病原體雞后氣管黏膜掃描電鏡觀察

彭芳珍,王書揚,佘銳萍,胡艷欣,靳 紅

(1.安慶師范大學生命科學學院,安徽 安慶 246052;2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 海淀 100193;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技教育司,北京 朝陽 100026)

雞傳染性支氣管炎(IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的雞的一種急性高度接觸性傳染病,主要侵害雞的呼吸、泌尿生殖和消化系統(tǒng)等,可導致不同日齡的雞發(fā)生不同程度的危害。IBV往往引起復合感染(如新城疫、慢性呼吸道病等),并可繼發(fā)細菌性疾病如大腸桿菌病、沙門菌病等,從而加重了對雞群的危害。IBV是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的主要疫病之一[1-4],國內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)每年因該病導致直接經(jīng)濟損失達數(shù)億元人民幣。為了從微觀水平觀察接種IBV后雛雞氣管黏膜結(jié)構(gòu)的變化,本研究選取接種IBV后不同日齡的氣管下段組織進行了掃描電鏡觀察,試驗結(jié)果為IBV的發(fā)病機理的研究提供了形態(tài)學證據(jù),進而為IB的綜合防治提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 IBV毒株 M41株,由中國農(nóng)業(yè)大學傳染病與微生物教研室提供,ELD50=10-5.63/0.1 mL。

1.2 飼料 雛雞全價飼料,購自中國農(nóng)業(yè)大學震亞飼料廠。

1.3 實驗動物 80只14日齡無特定病原體動物(Specific Pathogen Free,SPF)白來航雞,購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。隨機平均分為對照組和試驗組。

1.4 主要設(shè)備 日立HCP-2臨界點二氧化碳干燥儀;離子濺射儀日立IB-5;日立S-570掃描電鏡。

1.5 樣品的準備 試驗組雛雞用M41株尿囊液滴鼻點眼,0.3 mL/只。攻毒后5 d和7 d分別取試驗組和對照組各5只雞,頸靜脈放血處死,采取氣管下1/3段,在2.5%戊二醛-多聚甲醛混合固定液中充分固定后,備用。對試驗組死亡雞只及時剖檢,觀察、記錄大體病理變化。

1.6 掃描電鏡樣品的制作 掃描電鏡樣品具體的制作過程如下：取已經(jīng)固定好的樣品,修成大小為1 mm3左右的小塊;PBS(0.1 mol/L,pH值7.4～7.6)沖洗;鋨酸(1%)后固定1 h;PBS(0.1 mol/L,pH值7.4～7.6)沖洗3×5 min;用梯度乙醇逐級脫水(乙醇濃度從30% ～100%);醋酸異戊酯置換,4℃過夜;日立HCP-2臨界點二氧化碳干燥儀干燥;粘臺(每種樣品分別有俯視觀察面和側(cè)視觀察面?zhèn)€一個樣品);噴金(離子濺射儀 日立 IB-5);日立S-570掃描電鏡觀察拍照。

2 試驗結(jié)果

掃描電鏡觀察到的結(jié)果如下(參見圖1～8)。

圖1 感染后5 d對照組氣管表面纖毛排列整齊,見杯狀細胞 SEM,2 900×

圖1為感染后第5天對照組雛雞氣管掃描電鏡圖,從圖中可見,雛雞氣管表面纖毛排列整齊,似麥浪樣,還可見杯狀細胞,細胞間聯(lián)系致密。圖2為感染后第5天試驗組雛雞氣管掃描電鏡圖,從圖中可見,感染組雛雞氣管表面纖毛集結(jié)成束,表面有大量黏液附著,纖毛擺動無力,杯狀細胞已不易觀察到。

圖3為感染后第7天對照組雛雞氣管掃描電鏡圖,從圖中可見,氣管表面纖毛排列整齊,似麥浪樣,杯狀細胞清晰可見,細胞間聯(lián)系致密。圖4為感染后第7天氣管掃描電鏡圖,從圖中可見,氣管表面纖毛已完全被黏液覆蓋,纖毛粘連,看不見杯狀細胞。

圖2 感染后5天試驗組氣管表面有黏液附著,纖毛粘集 SEM,2 500×

圖3 感染后7 d對照組氣管表面纖毛排列整齊,杯狀細胞清晰可見 SEM,2 150×

另外,感染后氣管還出現(xiàn)黏膜脫落,固有層裸露,氣管表面可見大量炎性細胞滲出,還可見紅細胞的穿出,隨感染期的延長,這些癥狀有加劇趨勢(圖5～8)。

圖4 感染后7 d試驗組氣管表面大量黏液覆蓋 SEM,2 000×

圖5 感染后5 d,氣管表面炎性細胞滲出SEM,2 000×

圖6 感染后7 d,氣管表面炎性細胞滲出明顯增多 SEM,1 000×

圖7 感染后5 d,部分氣管黏膜脫落,炎性細胞從固有層穿出 SEM,1 000×

3 討論

氣管黏膜上皮為假復層纖毛柱狀上皮,主要由纖毛柱狀上皮細胞、杯狀細胞以及基細胞等構(gòu)成。

纖毛具有凈化呼吸道的重要功能,正常情況下,纖毛擺動頻率為5～20 Hz,黏液的黏度以及心跳和呼吸頻率可影響纖毛擺動頻率。纖毛內(nèi)、外臂中的動力蛋白,即ATP酶提供能量,使得相鄰纖毛依次按一定順序有規(guī)律地向咽側(cè)擺動,產(chǎn)生推力,將上皮細胞表面的黏液及附著在其上的塵埃和細菌等異物推向咽部并排出[5]。

慢性支氣管炎患者的纖毛細胞內(nèi)可見線粒體腫脹和嵴斷裂;長期吸煙者纖毛細胞的纖毛會減少或消失;纖毛無運動綜合征患者出現(xiàn)呼吸道部分纖毛細胞的結(jié)構(gòu)異常,從而導致纖毛運動不協(xié)調(diào)而不能有效地發(fā)揮其清除異物的功能。

除了形態(tài)學方法外,也可檢測氣管纖毛的運動來評價呼吸道黏膜屏障功能。在人醫(yī)常采用亞甲藍移動情況觀察及氣管黏膜標本錄像觀察的方式統(tǒng)計得到氣管黏膜纖毛的功能指標,包括黏膜纖毛清除率(MCC)、黏膜纖毛輸送率(MTR)及纖毛擺動頻率(CBF)等,支氣管擴張患者的氣管黏膜纖毛的功能指標相對低下[6]。氣管離體時,可采用墨水示蹤法、墨粉示蹤法與紅細胞示蹤法等示蹤法測定氣管纖毛擺動活性數(shù)據(jù)[7]。

杯狀細胞的糖原顆粒以出胞方式排出黏蛋白,分布在纖毛頂端,與壁內(nèi)腺體的分泌物共同組成黏液層。黏液層可粘附吸入空氣中的顆粒物質(zhì),通過纖毛的定向擺動,使黏液及其所粘附的異物向咽部移動并排出。但是病理情況下,杯狀細胞會呈現(xiàn)區(qū)域性增多,黏液分泌亢進,管腔內(nèi)黏液增多,同進黏膜下層的混合腺(主要為黏液腺)也會增生肥大,黏液分泌量增多,過量的黏液會積聚潴留在管腔內(nèi),影響呼吸系統(tǒng)的正常清潔功能。

基細胞位于上皮基部,是一種未分化的干細胞,有增殖能力。在上皮損傷時,可增殖分化形成其他上皮細胞。

IBV感染雛雞的組織切片可見氣管黏膜上皮的杯狀細胞明顯增多,黏液腺增生肥大,開口增多,腺體分泌亢進。從圖2,圖4可見,感染IBV后黏液分泌明顯增多,從圖5～8可見,氣管部分纖毛及黏膜脫落,固有層裸露,同時可見有紅細胞等炎性細胞從氣管固有層細胞間穿出。這可能是由于病毒在氣管黏膜上皮細胞內(nèi)大量增生繁殖,嚴重影響到纖毛上皮的功能,從而導致氣管等呼吸系統(tǒng)的炎癥,黏液增多,氣管黏膜上皮受損出現(xiàn)出血癥狀。同時由于纖毛柱狀細胞的受損及黏液分泌的亢進,雞只表現(xiàn)為伸頸,張口呼吸,咳嗽,并出現(xiàn)氣管啰音。剖檢死亡雞只也可見到呼吸道內(nèi)有漿液性、卡他性和干酪樣的滲出物。

以上觀察到的氣管黏膜表面的超微結(jié)構(gòu)變化表明,在IBV感染雞只后,機體防御呼吸系統(tǒng)疾病的重要門戶-氣管的結(jié)構(gòu)與功能受損,必然影響到機體對疾病的抵抗能力,這也進一步為IB的發(fā)病機理提供了形態(tài)學上的依據(jù)。