山東不同地區乳房炎和非乳房炎牛奶中主要病原菌的調查

張青青,李月華,趙建梅,馬金梅,劉煥奇,曲志娜

(1.青島農業大學動物醫學院,山東 青島 266109;2.中國動物衛生與流行病學中心,山東 青島 266032;3.蓬萊市畜牧獸醫工作站,山東 蓬萊 265600)

牛奶作為生活中的必備品,關系到人們的身心健康,日常所飲用的牛奶都是經過消毒、滅菌后投入市場中,但是新鮮牛乳中的病原菌是不可忽視的。奶牛乳房炎作為當今世界各國奶牛生產中經濟損失最多的疾病之一,主要病因是多種病原微生物的感染。研究表明,牛奶中主要病原菌為金黃色葡萄球菌,其次為大腸桿菌和鏈球菌[1-4]。且大腸桿菌是一種條件致病菌,大多數是人和動物腸道內的正常菌群,但也有一部分具有致病性,致病性大腸桿菌會對畜牧業養殖造成一定的經濟損失,危害人類健康。

本試驗采集山東13個地級市的奶樣,樣品包含非乳房炎奶樣和乳房炎奶樣,對奶樣進行金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌的分離鑒定,并對分離到的大腸桿菌進行系統進化群分析,以期了解山東地區牛奶中主要病原菌的流行情況以及大腸桿菌的致病情況,為后期病原菌耐藥性以及菌株分子流行情況提供支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 7.5%氯化鈉肉湯、NB肉湯、乙基紫疊氮鈉肉湯、胰蛋白胨大豆肉湯、MH肉湯;金黃色葡萄球菌顯色培養基、麥康凱瓊脂、三糖鐵瓊脂、細菌瓊脂粉、哥倫比亞血瓊脂基礎、糖發酵管、凍干兔血漿;大腸桿菌生化鑒定條以及試劑盒;Swarm瓊脂、GoTaqGreen Master Mix酶、DNA Marker DL-1 000。

1.2 樣品采集 本試驗采集了山東省13個地區35個牧場的非乳房炎奶樣985份和乳房炎奶樣284份,每份奶樣來自奶牛的一個乳區。取樣前先用溫水清洗乳房,然后依次用0.2%新潔爾滅浸泡的紗布、75%酒精棉擦拭消毒乳頭,擠去采樣乳區的頭3把奶后采集乳汁5 mL于滅菌試管中,做好標記后4℃ 保存帶回實驗室,進行相關試驗。

1.3 細菌分離培養與純化 每份樣品各取3份,每份1 mL置于滅菌離心管中,12000 r/min離心2 min后,棄上層液體,留底部沉淀物。3份沉淀物分別經7.5%NaCl肉湯、NB肉湯和乙基紫疊氮鈉肉湯37℃培養18～24 h后再分別于金黃色葡萄球菌顯色培養基、麥康凱培養基、哥倫比亞血平板上分離純化培養,觀察菌落形態,直到顯色培養基上沒有雜菌即可。

疑似金黃色葡萄球菌在顯色培養基上菌落呈(淺)紫紅色;疑似大腸桿菌在麥康凱培養基上呈表面光滑的紅色菌落;疑似鏈球菌在哥倫比亞血平板上呈淡灰色、隆起、閃光的小菌落,無乳鏈球菌常呈α或β溶血,但有的菌株不溶血;停乳鏈球菌和乳房鏈球菌一般不溶血,有時也可產生微弱的α溶血。

1.4 大腸桿菌系統進化群分析 利用PCR方法擴增菌株的chuA和yjaA基因以及DNA片段TspE4.C2,引物序列由擎科生物公司合成,見表1。根據結果對菌株進行系統進化群分析[5],判定標準見表2。

表1 引物序列及目的片段大小

表2 大腸桿菌系統進化群判定標準

1.5 細菌鑒定

1.5.1 PCR鑒定 對金黃色葡萄球菌和鏈球菌進行PCR鑒定,引物[6-7]由擎科生物公司合成,見表3。將分離的疑似菌株經PCR擴增、電泳鑒定,同時擴增出16s RNA、nuc條帶的菌株為金黃色葡萄球菌,如圖1;擴增出sip1、sip2和sip3的分別為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌,電泳結果見圖2。

表3 引物序列及目的片段大小

圖1 金黃色葡萄球菌電泳鑒定結果

圖2 三種鏈球菌電泳結果

1.5.2 生化鑒定

對葡萄球菌疑似菌株進行血漿凝固酶試驗;大腸桿菌疑似菌株進行三糖鐵、生化鑒定條試驗;鏈球菌疑似菌株進行CAMP、馬尿酸鈉、七葉苷、甘露醇、山梨醇、乳糖和水楊苷試驗,觀察其結果。

1.6 數據處理

利用卡方檢驗對數據進行差異顯著性分析,P≤0.01,差異極顯著;P＜0.05,差異顯著;P＞0.05,差異不顯著。

2 結果

2.1 生化鑒定結果

2.1.1 金黃色葡萄球菌血漿凝固酶試驗結果 結果顯示為膠凍樣固體的為凝固酶陽性菌株,結果顯示為肉湯液體的為凝固酶陰性菌株。

2.1.2 大腸桿菌生化試驗結果 大腸桿菌在三糖鐵斜面試驗中產生斜面黃色/底層黃色現象的為陽性菌株,斜面/底層產生黑色現象的為陰性菌株;根據大腸桿菌生化鑒定條使用說明書進行判定,靛基質、甲基紅、V-P試驗和西蒙氏枸櫞酸鹽生化反應結果依次為++--的細菌為陽性菌株,其他為陰性菌株。

2.1.3 鏈球菌生化鑒定試驗 對分離到的鏈球菌疑似菌株進行CAMP試驗,原來不溶血或者溶血不明顯的無乳鏈球菌會呈明顯的β溶血,再進行生化鑒定試驗,根據顏色變化進行判斷,判斷結果參照表4。

表4 鏈球菌生化鑒定結果判斷

2.2 樣品檢測結果

2.2.1 樣品總體檢測概況 本試驗采集了山東13個地區35個牧場1 269份樣品,其中非乳房炎樣品985份,乳房炎樣品284份,通過分離鑒定試驗,共分離到422株菌,陽性率為33.25%,其中金黃色葡萄球菌樣品檢出率為11.82%(150/1 269)、大腸桿菌19.54%(248/1 269)、無乳鏈球菌2.76%(35/1 269)、停乳鏈球菌1.42%(18/1 269)、乳房鏈球菌 3.86%(49/1 269)。結果見表5。

表5 山東各地區奶樣數量、菌株分離情況與分離率

2.2.2 非乳房炎/乳房炎樣品檢測結果比較 非乳房炎和乳房炎樣品中各種細菌檢測結果見表5和圖3。結合表5和圖3可知,乳房炎/非乳房炎樣品中大腸桿菌檢出率(23.24%/18.48%),均高于其他4種細菌的檢出率,其次是金黃色葡萄球菌;統計學分析得出,乳房炎樣品中金黃色葡萄球菌檢出率(15.14%)高于非乳房炎樣品(10.86%),差異顯著(P=0.049);乳房炎樣品中大腸桿菌檢出率(23.24%)與非乳房炎(18.48%)差異不顯著(P=0.075);乳房炎樣品中鏈球菌檢出率(13.03%)高于非乳房炎(6.60%),差異極顯著(P=0.000 5)。從3種細菌總體檢出率來看,乳房炎中細菌檢出率(51.41%)明顯高于非乳房炎(35.94%)(P=2.60E-06),說明乳房炎與病原菌的存在有關。

圖3 非乳房炎/乳房炎樣品檢出率

2.2.3 不同地區樣品檢測結果比較 不同地區樣品中各種細菌檢出結果見表5和封三彩版圖4。

由表5和圖4可知,青島地區樣品檢出率(67.91%)高于其他地區,金黃色葡萄球菌在青島檢出率(50.0%)最高,其次是日照(25.0%)、棗莊(18.79%)和臨沂(16.28%),而在泰安、濟寧、菏澤和煙臺并未檢出;大腸桿菌在東營的檢出率(40.0%)最高,而在日照并未檢出;無乳鏈球菌和停乳鏈球菌在各地的檢出率總體不高,且無明顯差異;而乳房鏈球菌在日照的檢出率(31.25%)最高,其次是東營地區(15.0%),在德州和淄博并未檢出。

圖4 不同地區樣品檢測結果

2.2.4 不同時間樣品檢測結果比較 不同采樣時間樣品檢測結果見表6和圖5。

表6 不同采樣時間與樣品檢測率

圖5 不同采樣時間樣品檢出結果

由表6可知,6月樣品檢出率(67.91%)最高,明顯高于其他時間(P=3.24E-26),12月最低(16.28%);圖5可知,樣品檢出率隨著采樣時間的推移呈現下降趨勢;9月和10月檢出率差異不明顯(P=0.846),11月和12月檢出率差異不明顯(P=0.421)。

2.2.5 大腸桿菌系統進化群分群結果 248株大腸桿菌通過系統進化群分析,得到共生群A群213株,檢出率為85.89%;致病群35株,檢出率為14.11%,其中低致病群B1群29株,檢出率為11.69%,高致病群B2群2株和D群4株,檢出率分別為0.81%和1.61%,由此可見,分離到的大腸桿菌多數不是致病菌株,具體結果見表7和圖6。由表7可知,非乳房炎樣品中大腸桿菌共生群A群為161株,占88.95%,致病群20株,占11.05%;而乳房炎樣品中大腸桿菌共生群A群為52株,占77.61%,致病群15株,占22.39%。統計學分析得出,乳房炎樣品致病群的檢出率(22.39%)明顯高于非乳房炎(11.05%)(P=0.023),說明乳房炎的發生與致病菌有關。

表7 大腸桿菌系統進化群分群統計結果

圖6 大腸桿菌系統進化群分群統計結果

3 討論

3.1 細菌分離鑒定 試驗奶樣來自山東13個地級市的非乳房炎和乳房炎奶樣,采樣具有廣泛代表性。研究表明,主要病原菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌,故本研究也圍繞這3種細菌開展相關試驗。結果顯示,大腸桿菌分離率為19.54%,這與丁丹丹[8]等調查河南省分離率(21.51%)和趙秋云[9]等調查陜西地區分離率(22.22%)結果相似;而金黃色葡萄球菌分離率為11.82%,這與覃杰[10]等調查新疆鐵門地區分離率(33.6%)、薛梅[11]等調查濰坊分離率(34.34%)和易明梅[12]等調查上海地區分離率(69.16%)的結果相差較大;鏈球菌分離率為8.04%,與項開合[13]調查丹東地區鏈球菌分離率(35.25%)和王金濤[14]等調查黑龍江墾區分離率(32%)結果不一致。分析原因發現,這些研究主要是針對奶牛乳房炎樣品,而本試驗樣品包含非乳房炎和乳房炎奶樣,使得金黃色葡萄球菌和鏈球菌的分離率低;其次地區不同對于細菌的分離情況也有所差異;最后通過本試驗分析,細菌分離率也與采樣時間有關,從表6可以看出,6月細菌檢出率(67.91%)最高,因為6月份天氣炎熱,空氣潮濕,使奶牛應激反應大,免疫力下降,細菌大量繁殖,造成乳房炎的發生,且乳房炎以夏季發病率最高,其次是秋季,最低是冬季;隨著采樣時間的推移,乳房炎奶樣數量減少,且奶樣中細菌檢出率減低。

3.2 大腸桿菌系統進化群分析 大腸桿菌系統進化群可以分為A、B1、B2和D四個群,A群一般為共生群,B1為低致病群、B2和D群為高致病群。系統進化群的分布與動物種類、動物健康狀態和地理位置有關[15],目前大多數研究對象為禽和豬,而關于牛奶中大腸桿菌系統進化群的相關研究幾乎沒有,所以在大腸桿菌分離的基礎上開展了相關試驗。結果顯示,A群檢出率(85.89%)最高,致病群檢出率為14.11%,說明我們在對大腸桿菌進行分離鑒定時也要對其致病群進行相關研究。通過差異顯著性分析,乳房炎樣品致病群檢出率(22.39%)明顯高于非乳房炎(11.05%)(P=0.023),說明奶牛發生乳房炎與致病群的存在有關。另外,與其他動物中大腸桿菌的分群結果相比存在差異,牛春玲[16]對來自江蘇、安徽、山東等地區病死鴨的480株大腸桿菌進行了系統進化群分析,結果表明A群最高(56.25%);其次是B2群(19.17%)。蘇志新[17]對來自上海閔行區周邊病死雞的80株大腸桿菌進行系統進化群分析,結果表明B1群為優勢進化群。本試驗中高致病群B2群的菌株在非乳房炎奶樣中檢出,說明大腸桿菌作為一種條件致病菌,在健康奶牛中也會存在高致病菌株,而這些菌株在適宜條件下也會導致奶牛患病,所以牧場要加強養殖衛生狀況和飼養管理水平,提前預防乳房炎的發生。