藍舌病16型病毒核心樣顆粒的獲取與鑒定

王 瀟,黃超華,曹琛福,史衛軍,花群義,陳金頂

(1.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心,廣東 深圳 518045;2.華南農業大學獸醫學院,廣東 廣州 510642)

藍舌病(Bluetongue,BT)是由呼腸孤病毒科、環狀病毒屬藍舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起,主要是由庫蠓傳播的反芻動物非接觸性病毒性傳染病。藍舌病已被世界動物衛生組織(OIE)認為是影響反芻動物最重要的疾病之一[1]。藍舌病早在19世紀發現于南非,并蔓延到熱帶、亞熱帶和溫帶等多個地區[2]。1979年我國首次在云南省確定藍舌病的發生后,相繼又在湖北省、安徽省、四川省、山西省暴發過此病。現已確認有29種血清型,而我國主要的致病血清型為16型[3-4]。近年來在我國的藍舌病流行呈上升趨勢,如何有效的控制該病的流行,引起越來越多人的關注。目前,我國已經研制出藍舌病的弱毒疫苗和滅活疫苗,但它們保護效果欠佳,并且存在一些弊端,因此研究者將目光轉移到研制新型基因工程疫苗上[5],主要集中在藍舌病病毒樣顆粒(Virus Like Particle,VLP)上[6]。

藍舌病核心樣顆粒由藍舌病結構蛋白VP2、VP3、VP5和VP7構成,其中VP3和VP7可裝配成藍舌病病毒核心樣顆粒(Core Like Particles,CLP)。CLP雖然不能刺激機體產生中和抗體,但作為病毒樣顆粒的主體結構,在病毒樣顆粒的形成過程中起到至關重要的作用。本文通過利用桿狀病毒表達系統表達16血清型藍舌病病毒兩種主要的結構蛋白VP3和VP7,使其形成具有良好的抗原性和免疫原性的核心樣顆粒,為制備16血清型BTV VLP疫苗提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌(E.colI)DH5α、DH10Bac(含Bacmid質粒)、pFastBac Dual質粒、Cellfectin? II Reagent、SF-900Ⅲ培養基均為Invitrogen公司產品;限制性內切酶NotI、SacI、NcoI、NheI以及Taq酶均為TaKaRa公司產品;綿羊藍舌病陽性血清由英國動物衛生研究所(IAH)提供;Rabbit Anti-Sheep lgG H&L(HRP)為 Abcam公司產品;W-TMB顯色試劑為Sangon Biotech公司產品;昆蟲細胞Sf9為深圳出入境檢驗檢疫局保存。

1.2 方法

1.2.1 VP3、VP7基因的合成以及pFastBac Dual-VP7-VP3質粒的構建 以生工生物工程(上海)股份有限公司合成BTVVP7整個開放閱讀框,而獲得的重組質粒pUC-VP7為模板,上游引物VP7-S：5′-ATGGACACTATCGCTGCAAG-3′含有NotI酶切位點;下游引物 VP7-A：5′-TATGCGTAAGCGGCGCGTGC-3′,含有SacI酶切位點。進行PCR擴增,并將PCR擴增產物與質粒pFastBac Dual經限制性內切酶NotI、SacI酶切后,用T4 DNA連接酶在16℃條件下,反應3 h后,將反應產物轉化大腸桿菌DH5α。經鑒定后,將重組質粒命名為pFastBac Dual-VP7。按照同樣方法構建重組質粒pFastBacDual-VP7-VP3。其中可擴增VP3基因的 PCR上游引物為VP3-S：5′-AACGAGCAACGTCCGGAGAG-3′含有 NcoI酶切位點;下游引物為 VP3-A：5′-AGCCTACACAGTCGGCGCAG-3′,含有NheI酶切位點。

1.2.2 重組桿狀病毒的獲得及VP3、VP7基因的表達 用構建好的重組pFastBac Dual-VP7-VP3質粒,轉化大腸桿菌DH10Bac感受態菌后,平鋪到含有慶大霉素、卡那霉素、四環素、X-gal和IPTG的LB平板上,在37℃條件下,培養48 h后進行藍白菌落篩選,挑取白色菌落并鑒定。將鑒定后含有重組桿狀病毒DNA的菌落,進行提取Bacmid,并按照脂質體轉染試劑Cellfectin?II Reagent的說明書,將Bacmid轉染 Sf9細胞,觀察是否有細胞病變及減少的情況,從而獲得重組桿狀病毒。將獲得的重組桿狀病毒接入正常Sf9細胞,96 h后收集細胞,并進行SDS-PAGE以及Western Blot的驗證。

1.2.3 重組核心樣顆粒的收集與純化 收取重組病毒感染的細胞,加入適量的裂解緩沖液[50 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0),150 mmol/L NaCl,0.5%NP40(v/v)],經反復凍融后,放置4℃過夜。次日,4℃,10 000 r/min離心10 min,取上清,用PEG20 000包埋或者超濾管濃縮至適當體積,用不連續蔗糖密度梯度超速離心進行純化。用 Tris-Nacl緩沖液(50 mmol/L MTris-HCl,15 mmol/L NaCl pH值8.4)配置30%和50%蔗糖,在4℃,26 400 r/min水平轉頭離心3 h,收集離心管底部沉淀,再加入Tris-Nacl緩沖液,再次進行4℃,30 000 r/min水平轉頭離心3 h,進行純化,收集底部已純化的病毒核心樣顆粒,并進行SDS-PAGE及Western Blot驗證。

1.2.4 電鏡觀察 將提純的病毒樣顆粒直接用醋酸鈾負染或者經甲醛固定后按常規磷鎢酸負染后,將電鏡設置為×30.0 k放大倍數下進行觀察。

2 結果

2.1 重組質粒pFastBac Dual-VP7-VP3質粒構建及鑒定 將所構建的命名為pFastBac Dual-VP7質粒用限制性內切酶NotI、SacI對提取的質粒進行雙酶切鑒定,證實VP7已經成功克隆至表達載體pFast-Bac Dual。將構建的重組質粒pFastBac Dual-VP7-VP3經PCR擴增和限制性內切酶NcoI,NheI進行雙酶切鑒定,證實VP3成功克隆至表達載體pFastBac Dual-VP7。經送檢測序確認目的基因正確插入,最終證實重組pFastBac Dual-VP7-VP3質粒構建成功(圖1)。

圖1 重組桿狀病毒表達載體質粒結構

2.2 重組桿狀病毒的獲得及VP3、VP7蛋白的表達 用構建好的重組pFastBac Dual-VP7-VP3質粒,轉化大腸桿菌DH10Bac感受態菌,挑取白色菌落,通過菌落PCR鑒定后。按照大量提取試劑盒說明書,大量提取重組桿粒 Bacmid-VP7-VP3。將 Bacmid-VP7-VP3轉染Sf9細胞,72 h收集上清,再取適量的上清液接入健康的Sf9細胞,并設置正常細胞組,培養72 h后,將正常Sf9細胞組與接毒組(見封二彩版圖2)進行對比,觀察到接毒組細胞病變明顯,細胞體積增大,數量減少。收集上清獲得重組桿狀病毒。

圖2 轉染后Sf9細胞病變情況

2.3 重組核心樣顆粒的獲取與鑒定 收集重組桿狀病毒感染Sf9細胞并進行裂解處理后,將4℃,10 000 r/min離心10 min后取上清裂解液,進行不連續蔗糖密度梯度超速離心,將收集各層蛋白并進行驗證。結果顯示,核心樣顆粒位于離心管底部,并通過SDS-PAGE(圖3)及Western Blot(圖4)試驗驗證,均出現了兩條分別為100 kD和38 kD大小的目的條帶,所對應的蛋白分別為VP3、VP7。同時將底部蛋白進行負染后電鏡觀察,發現在離心管底部收集到的蛋白中含有大量的空心顆粒(圖5),其與藍舌病核心樣顆粒形態一致。藍舌病病毒是一種20面體結構,所以在電鏡下多數會呈現出正六角形,直徑大約為70 nm左右,與多篇文獻報道一致[7-10]。

圖3 純化的病毒樣顆粒SDS-PAGE驗證結果

3 討論

隨著藍舌病快速的傳播,對我國畜牧業及產品進出口貿易的發展帶來了嚴重影響[11]。目前我國用于藍舌病病毒預防的疫苗主要是滅活疫苗和弱毒疫苗,但是效果并不是很理想。弱毒疫苗雖然有用量小以及可以有效的控制地方流行性藍舌病暴發的優點,但是藍舌病病毒弱疫苗有致畸性,并且弱毒株也有可能與野毒株重組而產生新基因型毒株,引發一系列生物安全問題[12]。滅活疫苗雖然沒有毒性,但是,它免疫效果維持時間短,需要多次注射且要進行加強免疫,所以至今無法很好的運用于藍舌病的預防中。

圖4 純化的病毒樣顆粒Western Blot驗證結果

圖5 純化的病毒樣顆粒在電鏡×30.0 k放大倍數下的形態

隨著免疫學的發展,現如今重組技術已被用于藍舌病病毒疫苗的研究中,特別是關于核心樣顆粒或重組病毒樣顆粒疫苗的研制,更是越來越多,并取得了一定的成果。VLP疫苗技術發展迅速,應用性強,得到越來越多人肯定。VLPs制備的原理是在體外高效的表達某種病毒的一種或幾種主要的結構蛋白,使其能夠自動裝配成在形態上類似于天然病毒的空心顆粒,因此VLPs技術在病毒的自主組裝與形態多樣性等基礎研究中也發揮著重要作用[13-15]。

藍舌病病毒是一類無包膜且結構復雜的病毒,它外層蛋白外殼主要是由VP2和VP5蛋白構成,內層則主要是由VP3和VP7蛋白構成[16]。本文通過構建重組質粒pFastBac Dual-VP7-VP3,在昆蟲細胞中同時表達兩個主要的內層結構蛋白VP3、VP7,觀察其自主裝配BTV CLP情況。試驗結果表明,通過所構建的重組pFastBac Dual-VP7-VP3質粒,獲得重組桿狀病毒后感染Sf9細胞,通過密度梯度離心可以大量獲取核心樣病毒顆粒,并證實其具有良好的反應原性。在電鏡下也觀察到有病毒核心樣顆粒的形成。本文的試驗結果與王健偉[10]等的研究結果相似。與之相比,本研究在梯度離心和核心樣顆粒收集過程中作了一些改進,如采用30%和50%蔗糖進行梯度離心,收集沉淀后,再加入緩沖溶液,通過加大離心力的方式,進行再次離心,從而提升了核心樣顆粒的純化純度和效率;采用Tris-Nacl緩沖液(50 mMTris-HCl,15mmol/L MNaCl pH值8.4)溶解和保存核心樣顆粒,使之更加穩定;本研究以國內主要流行的藍舌病16型 VP3、VP7蛋白構建核心樣顆粒,為國內BTV VLP疫苗的研制以及藍舌病的防控工作打下基礎。