豬繁殖與呼吸綜合征病毒接觸感染仔豬模型的建立

夏文龍,吳 植,郭長明,朱善元,張鑫宇,夏曉莉,孫懷昌

(1.揚州大學獸醫學院 江蘇省重要動物疫病與人獸共患病協同創新中心,江蘇 揚州 225009;2.江蘇農牧科技職業學院 江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室,江蘇 泰州 225300)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是豬的一種高度接觸性傳染病,以母豬繁殖障礙、仔豬死亡率升高及各年齡豬呼吸道癥狀為主要特征。該病于1995年傳入我國[2],現已成為現代化養豬場最重要的傳染病,給我國養豬業帶來了巨大的經濟損失。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是動脈炎病毒科成員,主要感染豬的單核-巨噬細胞系統,導致嚴重的免疫抑制[2]。另外,PRRSV具有毒株多、變異快等特點,也是難以凈化和根除的主要原因。

PRRSV感染模型對其致病機制研究和疫苗評價具有重要意義。PRRSV傳播方式包括直接接觸和間接接觸,其中直接接觸感染性分泌液是最有效的傳播方式[3]。然而,先前的PRRSV試驗感染多用肌肉注射或滴鼻方式進行[4-5],感染途徑不同于PRRSV的自然感染,另外,試驗豬多飼養于普通環境中,對其疾病表現影響較大。本研究先以肌肉注射加滴鼻接種方法獲得人工感染仔豬,然后將其與易感仔豬在隔離器內進行同居飼養,對接觸感染豬的體溫、臨床癥狀、病毒血癥、糞便排毒、器官病毒載量以及剖檢和顯微病變進行系統的檢測分析,旨在建立PRRSV接觸感染仔豬模型。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 AxyPrep質粒DNA小提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒,購自 AXYGEN公司;DL-1 000 DNA Marker、rTaqDNA 聚合酶、pMD-18T 載體、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、Prime-Script RT Master Mix、SYBR PremixEx TaqII,購自TaKaRa公司;PRRSV ELISA檢測試劑盒,購自IDEXX公司。

1.2 病毒、細胞和試驗動物 豬圓環病毒2型(PCV2)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HR-PRRSV)JXA1毒株均由本實驗室保存;Marc-145細胞由本實驗室保存;28日齡杜×長×大三元雜交斷奶仔豬,購自江蘇如東某PRRS非免疫豬場。

1.3 試驗豬常見病原及PRRSV抗體檢測 將7頭28日齡斷奶仔豬于負壓隔離器中飼養3～5 d,觀察健康狀況良好,前腔靜脈采集血液分離血清,用病毒RNA/DNA提取試劑盒提取病毒核酸,參考文獻[6]設計合成 PCV2、PPV、PRV、CSFV 和 PRRSV 特異引物(表1),通過PCR/RT-PCR檢測上述病原,采用ELISA試劑盒檢測PRRSV特異抗體。

1.4 試驗分組 將6頭仔豬隨機分為2組,第1組為接觸感染組,將3頭易感仔豬與1頭PRRSV試驗感染仔豬(肌肉注射+滴鼻接種105TCID50JXA1株PRRSV)于同一隔離器同居飼養;第2組為對照組,將3頭仔豬于另一隔離器中飼養。

1.5 試驗豬的臨床觀察及樣品采集 同居飼養后每天定時測量記錄直腸溫度1次,每天觀察臨床癥狀3次并根據表2臨床癥狀評分標準[7]進行評分;在感染后第 1、3、5、7、10、13 天,前腔靜脈采集血液5 mL進行血清分離,采集的糞便樣品(1 g/頭)用10 mL PBS重懸,5 000 r/min離心10 min取上清用于病毒檢測;兩周后,對死亡和試驗結束迫殺豬進行剖檢,觀察各組織器官大體病變并剪取小塊肺臟組織制備病理切片;采集心、肝、脾、肺、腎、淋巴結,所有樣品于-80℃冰箱凍存。

表1 試驗豬病毒檢測的PCR引物

表2 臨床癥狀評分標準

1.6 臨床樣品的熒光定量RT-PCR檢測 不同時間采集的豬血清和糞便懸液離心上清各取200 μL,每頭豬的組織器官各取50 mg,利用試劑盒分別提取上述樣品病毒RNA并進行反轉錄,參考本課題組已建立的熒光定量RT-PCR方法[6],檢測PRRSV基因組RNA拷貝數,PCR反應程序為：95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 31 s,共40個循環,延伸結束收集熒光信號。

2 結果

2.1 試驗豬常見病原及PRRSV抗體檢測 采集各試驗仔豬血清樣品,利用PCR/RT-PCR檢測常見豬病病毒,結果顯示：作為陽性對照的 PCV2、PPV、PRV、CSFV、PRRSV均可擴增出預期大小的基因片段,而7頭試驗豬的血清樣品均為檢測陰性(圖1);ELISA試劑盒檢測結果顯示,7頭試驗豬均為PRRSV抗體檢測陰性,這些結果表明該仔豬可以用于PRRSV感染試驗。

圖1 試驗仔豬的病毒檢測

2.2 試驗豬體溫和死亡觀察 在為期兩周的試驗過程中,每日監測各仔豬體溫,結果顯示(圖2)：未接種對照組的3頭仔豬體溫正常;肌肉注射+滴鼻接種JXA1株PRRSV的1頭仔豬第2天體溫升高至40.8℃,第5天升高至41.0℃并持續高熱至第11天死亡。在接觸感染后,第4天3頭仔豬平均體溫達40.6℃,第6天高于41.0℃并持續高熱,分別于第12、13天死亡。表明和帶病豬同居接觸2天后,健康仔豬即可出現高熱并且持續致死,死亡時間較人工攻毒豬推遲1～2天。

圖2 試驗仔豬的體溫監測

2.3 試驗豬臨床癥狀評分 試驗期間每日觀察各仔豬臨床癥狀并進行評分,結果顯示(圖3)：空白對照組所有仔豬未出現明顯臨床癥狀;人工接種病毒的仔豬第2～5天表現出精神沉郁、食欲下降等輕微癥狀(共計3～6分),第6天開始出現喘氣、咳嗽、呼吸困難、眼瞼水腫、腹瀉等PRRSV典型癥狀,持續直至死亡(共計14～16分);接觸感染的3頭仔豬第5～6天表現出輕微癥狀(共計4～5分),第7天開始臨床癥狀明顯嚴重直至死亡(共計14～16分)。表明JXA1株PRRSV能夠通過同居接觸感染健康仔豬并引起典型且一致的PRRS臨床癥狀,潛伏期為3天左右。

圖3 試驗仔豬臨床癥狀評分

2.4 試驗豬病毒血癥檢測 定期采集試驗仔豬血液并分離血清,用熒光定量RT-PCR進行病毒血癥檢測,結果顯示(圖4),空白對照組仔豬血清檢測結果均為陰性;人工攻毒后24 h仔豬血清即為PRRSV檢測陽性,第1～5天病毒血癥逐漸上升(105.6～8.4拷貝/mL),此后穩定在較高水平(108.7拷貝/mL)直至死亡;接觸感染仔豬在第3天檢出PRRSV,第3～10天血清中PRRSV含量呈上升趨勢(103.4-8.6拷貝/mL),并維持較高含量(108.7拷貝/mL)至死亡。表明健康仔豬與人工攻毒豬同居接觸2 d左右即感染JXA1株PRRSV,并且二者的病毒血癥發展趨勢及PRRSV含量高峰值相似。

圖4 PRRSV感染豬的病毒血癥定量RT-PCR檢測

2.5 試驗豬糞便排毒檢測 定期采集試驗仔豬糞樣,熒光定量RT-PCR檢測結果顯示(圖5),空白對照組仔豬糞便檢測結果均為陰性;人工接種仔豬第3天糞便為PRRSV檢測陽性,第3～7天病毒含量逐漸升高(103.3～4.4拷貝/0.1 g),隨后維持較高水平(104.5拷貝/0.1 g)至死亡;接觸感染仔豬于第5天首次檢出病毒,第5～7天PRRSV含量呈上升趨勢(101.8～4.0拷貝/0.1 g),此后糞便排毒量穩定在較高水平(103.9～4.2拷貝/0.1 g)至死亡。表明仔豬接觸感染PRRSV后,能夠通過糞便持續排毒,并且排毒趨勢及最高排毒量和人工攻毒豬相似。

圖5 PRRSV感染豬的糞便排毒定量RT-PCR檢測

2.6 試驗豬病理變化觀察 試驗期間仔豬死亡后立即進行剖檢,結果顯示,死于人工接種和同居接觸感染仔豬的病變明顯且相似,腹股溝及腸系膜淋巴結明顯紅腫、出血,腎臟表面可見大小不一出血點(未列出),肺臟作為PRRSV主要侵害器官,表現為嚴重實變、紅腫、出血,進一步對其進行病理切片觀察,結果顯示(見封二彩版圖6),死于人工接種和同居接觸感染仔豬均呈現典型間質性肺炎,肺泡壁增厚,淋巴細胞浸潤;空白對照組仔豬撲殺后各器官無明顯病變

圖6 試驗豬肺臟病理變化觀察

2.7 組織器官病毒載量檢測 用熒光定量RTPCR對病死或試驗結束后迫殺豬的主要組織器官進行PRRSV基因拷貝數檢測,結果顯示(圖7),空白對照組所有仔豬相應組織器官均為PRRSV檢測陰性;人工攻毒和接觸感染豬主要器官均含大量病毒,其中肺臟含量最高,分別為107.5和106.9～7.7拷貝/mg。表明JXA1株PRRSV能夠通過同居接觸感染健康仔豬并在豬體內大量復制,而且死亡豬各器官病毒載量及分布和人工攻毒豬無明顯差異。

圖7 PRRSV感染豬組織器官病毒載量檢測

3 討論

仔豬對PRRSV的易感性與病毒毒力、宿主免疫狀態和環境因素密切相關[6]。盡管PRRSV具有高度的接觸傳染性,但接觸感染的實驗研究尚無報道。先前的PRSSV人工感染多通過肌肉注射或滴鼻方式進行,不僅不能真實反映PRRSV的自然感染,而且成功率較低[8]。本研究先用人工接種法獲得PRRSV感染仔豬,然后立即將其與易感仔豬進行同居飼養,旨在模擬PRRSV自然感染。臨床觀察結果顯示,人工接種和接觸感染仔豬不僅出現典型、一致的PRRS癥狀,而且都于感染后兩周內死亡。本研究復制PRRS成功率高的可能原因主要有：一是使用的JXA1株不僅是高致病性PRRSV毒株,而且試驗前經過3次易感豬傳代復壯,所以其毒力較強;二是試驗豬為PRRSV及其抗體檢測雙陰性,提示其易感性較高;三是試驗豬在負壓隔離器中飼養,受環境因素干擾較小。

臨床觀察結果顯示,人工接種仔豬于第2天出現體溫升高和臨床癥狀,而接觸感染仔豬于第4天體溫開始升高,第5天出現PRRS典型癥狀,提示強毒株PRRSV自然感染的潛伏期為2～3 d。與人工接種豬相比,盡管接觸感染豬的臨床癥狀和病毒血癥出現時間有所延遲,但體溫升高程度、臨床癥狀打分、病毒血癥水平和病理變化無明顯差異,表明同居接觸感染更能反映PRRSV的自然感染。

目前對于PRRSV能否通過糞便排毒尚存爭議,可能與豬的品種、病毒的毒力、采樣以及檢測方法有關[9-10]。在本試驗中,接觸感染仔豬在同居飼養后第5天為PRRSV RT-PCR檢測陽性,而且維持在較高水平直至死亡,表明至少強毒株PRRSV確能通過感染豬糞便排毒。本課題組的前期研究結果顯示[6],盡管PRRSV人工接種仔豬糞便從攻毒后第2天直至死亡都為RT-PCR檢測陽性,但糞便樣品需濃縮后才可分離到感染性病毒,可能與PRRSV在糞便中的穩定性較差有關[11]。因此,糞便排毒在PRRSV水平傳播中的作用還有待進一步研究。