12種竹筍蛋白對腫瘤細胞體外增殖的抑制作用

楊慧敏 吳良如 楊金來

摘要 [目的]探討不同種類竹筍蛋白的抗癌活性。[方法]采用植物活性蛋白提取試劑盒提取竹筍蛋白，CCK-8法檢測不同濃度竹筍蛋白對胃癌細胞SGC-7901和結腸癌細胞HCT-116的增殖抑制作用，72 h后顯微拍照記錄細胞生長情況，并計算IC50值。[結果]12種竹筍蛋白在體外均可強效抑制胃癌細胞SGC-7901和結腸癌細胞HCT-116的增殖，但抑制效果并不完全相同，在一定范圍內，其抑制率與濃度呈正相關，呈現一定的劑量-效應關系。[結論]12種竹筍蛋白對腫瘤細胞，如胃癌細胞SGC-7901和結腸癌細胞HCT-116的增殖均有顯著的抑制作用，為今后進一步研發竹筍源的低毒、高效的抗腫瘤藥物奠定基礎。

關鍵詞 竹筍蛋白;人胃癌細胞SGC-7901;人結腸癌細胞HCT-116;增殖;抑制

中圖分類號 Q 946.1 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）12-0181-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.050

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract [Objective] The research aimed to investigate the anticancer activity of proteins of different species of bamboo shoots.[Method]The proteins of bamboo shoots were extracted with the plant active protein extraction kit.CCK8 assay was used to detect the inhibitory effect of proteins of bamboo shoots with different concentrations on the proliferation of gastric cancer cell SGC7901 and colon cancer cell HCT116.After 72 h，the growth of cells was observed and photographed by microscope，and its IC50 value was calculated.[Result]All proteins of the 12 kinds of bamboo shoots could strongly inhibit the proliferation of gastric cancer cell SGC7901 and colon cancer cell HCT116 in vitro，but the inhibitory effect was not completely the same.Within a certain range，the inhibitory rate was positively correlated with the concentration，showing a certain doseeffect relationship.[Conclusion]All proteins of the 12 kinds of bamboo shoot have significant inhibitory effects on the proliferation of tumor cells，such as gastric cancer cell SGC7901 and colon cancer cell HCT116，which provide a foundation for further research and development of the low toxicity and high efficiency antitumor drugs from bamboo shoots.

Key words Bamboo shoot protein;Gastric cancer cell SGC7901;Colon cancer cell HCT116;Proliferation;Inhibition

惡性腫瘤是危害人類生命和健康的嚴重疾病之一，從天然產物中篩選出能與癌癥發生、發展、形成等過程中各調節靶點特異結合的活性成分，已成為尋找抗癌藥物的新熱點。近年從植物中發現了越來越多的抗腫瘤活性蛋白或多肽，已成為藥物研發中的一個活躍領域。Porro等[1]將從苦瓜中分離出的蛋白與抗CD5單克隆抗體偶聯，結果表明，偶聯后的苦瓜蛋白在體外可抑制外周血單核細胞及人T細胞蛋白和 DNA的合成，并能抑制白血病小鼠病情的發展，有效率達80%;陳元[2]從蓖麻中分離到一個66 kD的蓖麻毒蛋白，該蛋白是一種廣譜型抗癌活性蛋白，對食道癌細胞EC109 和肝癌細胞 SMM7721 具有直接殺傷作用，并且在低劑量時就可以使癌細胞發生凋亡。一般認為植物源活性蛋白主要通過直接殺死腫瘤細胞和促進癌細胞凋亡[2];抗突變和抑制癌細胞擴散抑制腫瘤細胞的增殖[3];抑制蛋白質的合成抑制腫瘤細胞的增殖[4];抑制相關酶的活性抑制腫瘤細胞的轉移等途徑發揮抗腫瘤的作用[5-6]。

竹筍是從竹子根狀莖上萌發分化而成的膨大的芽和幼嫩的莖。Wang等[7]從麻竹筍中分離到一種20 kD的抗真菌蛋白Dendrocin，它能抑制菌絲體的生長，經分析N端序列發現其與類甜蛋白相似，但分子量更小些，且這種蛋白不像其他抗菌蛋白一樣具有紅細胞凝集和核糖核酸酶活性;Maekawa等[8]從竹筍中分離到3個與酪蛋白激酶 Ⅱ 相關的60S酸性核糖體P蛋白（13、15和35 kD）具有很強的體內磷酸化抑制作用。筆者曾就24個不同種屬的竹筍蛋白對人胃癌細胞SGC-7901和結腸癌細胞HCT-116的增殖活性進行研究，結果發現，24種竹筍蛋白在體外均可不同程度地抑制人胃癌細胞SGC-7901和結腸癌細胞HCT-116的增殖，并呈現出一定的濃度依賴關系[9]。基于此，該研究將對另外12種不同種屬的竹筍蛋白對人胃癌細胞SGC-7901和結腸癌細胞HCT-116的增殖活性進行研究，試圖從中篩選出對腫瘤細胞抑制作用更強的竹筍蛋白，為今后開發低毒、高效的抗腫瘤活性竹筍蛋白奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 竹筍。

桂竹、斑竹、唐竹、茶竿竹于2017年4月采集自臨安竹種園，撐綠竹3號、粉單竹、黃麻竹、吊絲單竹、馬來甜龍竹、勃氏甜龍竹、毛腳龍竹于2017年8月采集自福建永安竹種園，于-80 ℃中保存備用。

1.1.2 腫瘤細胞。人胃癌細胞株SGC-7901和人結腸癌細胞株HCT-116均購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫（http：//www.cellbank.org.cn/）。

1.1.3 主要試劑及試劑盒。胎牛血清（貨號：SH30396.03）和RPMI-1640培養基（貨號：SH30809.01）均購自Hyclone公司;CCK-8細胞增殖活性檢測試劑盒（貨號：CK04）購自日本DOJINDO 公司;改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒（貨號：C503041）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.4 主要儀器設備。

高通量組織研磨儀，Tissue Lyser Ⅱ，德國QIAGEN公司;酶標儀，800TSNB，美國BioTek公司;二氧化碳細胞培養箱，BC-J80SAB104-N，上海博訊實業有限公司;顯微鏡，BX53，日本奧林巴斯。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養。

復蘇胃癌細胞株SGC-7901和結腸癌細胞株HCT-116，采用RPMI1640培養基接種至細胞培養瓶，并置于5% CO2、 37 ℃二氧化碳培養箱中培養至對數生長期備用。

1.2.2 竹筍蛋白提取。

稱取0.8 g竹筍，剪碎后平均分裝到3～4管2 mL離心管中，加10% PVPP（交聯聚乙烯吡咯烷酮）和2顆5 mm磁珠，再加1.5 mL有SDS蛋白裂解液（含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%NP-40、20 mmol/L Tris，pH 8.0～8.5）、終濃度為1 mmol/L的PMSF（苯甲基磺酰氟）、2 mmol/L的EDTA，混勻，置于冰上5 min后，加入終濃度10 mmol/L DTT（二硫蘇糖醇）。利用組織研磨儀Tissue Lyser Ⅱ 破碎組織（120 s，60 Hz），取出磁珠，4 ℃，15 000 r/ min×離心20 min。將全部上清液轉入新的50 mL離心管中，加入5倍體積的10%冷TCA（三氯乙酸）/丙酮，加入終濃度10 mmol/L DTT，搗碎沉淀于-20 ℃放置2 h或過夜，12 000 r/min，4 ℃、離心20 min，棄上清。將沉淀轉入新的2 mL離心管中，加1 mL冷丙酮，加入終濃度10 mmol/L DTT，搗碎沉淀，于-20 ℃放置2 h后，15 000 r/min，4 ℃離心20 min，棄上清，重復此步驟，直至上清無色。風干沉淀，加入適量有SDS 蛋白裂解液，加1顆5 mmol/L磁珠，采用Tissue Lyser Ⅱ 振蕩（120 s，40 Hz），4 ℃，15 000 r/min離心15 min，棄上清。加入終濃度10 mmol/L DTT，56 ℃水浴1 h。冷卻至室溫，加終濃度55 mmol/L IAM（碘乙酰胺），暗室放置45 min。加入5倍體積冷丙酮沉淀樣品2 h，4 ℃、15 000 r/min離心15 min，棄上清。風干沉淀，加入適量無SDS L3裂解液，加1顆5 mm磁珠，采用Tissue Lyser Ⅱ 振蕩（120 s，40 Hz）、4 ℃、15 000 r/min離心15 min，上清即為竹筍蛋白質溶液。Bradford法測定蛋白液濃度，并分裝保存于-80 ℃。

1.2.3 竹筍蛋白孵育胃癌細胞株SGC-7901和結腸癌細胞株HCT-116。

將胃癌細胞株SGC-7901和結腸癌細胞株HCT-116細胞計數，按每孔3 000個細胞接種于96孔板，置于5% CO2、37 ℃細胞培養箱中培養，待細胞密度長至60%～70%時將竹筍蛋白按0.02 mg/mL與培養基一起作用于上述細胞，72 h后顯微拍照，記錄細胞生長狀況。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖活性。

細胞用竹筍蛋白（試驗前將竹筍蛋白用完全培養基按1∶5、1∶10、1∶20、1∶50和1∶100的比例稀釋）處理72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，混勻后培養箱中孵育1.5 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光度，按照以下公式計算細胞增殖抑制率：

抑制率 =（1-竹筍蛋白作用OD值/陰性對照OD值）×100%。

1.2.5 IC50值（半數抑制率）的計算。采用GraphPad Prism 軟件，根據上述各梯度濃度的增殖抑制率，計算其IC50值。

1.2.6 統計學分析。

所有試驗數據均采用SPSS v21.0（http：//spss.en.softonic.com/）統計學分析軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 12個竹種的分類信息

為了探討不同竹種的竹筍蛋白對胃癌細胞SGC-7901和結腸癌細胞HCT-116增殖的影響，選取了12個竹種進行研究。根據1996《中國植物志》第9（1）卷，其分類信息如表1所示[10]。

2.2 不同濃度竹筍蛋白對胃癌細胞株SGC-7901細胞增殖的抑制作用

將不同濃度竹筍蛋白作用于人胃癌細胞SGC-7901 72 h后，CCK-8法檢測細胞增殖情況，結果如圖1所示，12種竹筍蛋白均可抑制SGC-7901細胞增殖，在一定濃度范圍內，濃度越高抑制作用越明顯;其中綠皮黃筋竹、撐綠竹3號、粉單竹、黃麻竹、吊絲單竹、馬來甜龍竹和勃氏甜龍竹的竹筍蛋白濃度與細胞增殖抑制率呈正相關關系，隨蛋白濃度的增加對腫瘤細胞增殖的抑制作用越明顯，呈現顯著的劑量-效應關系;而桂竹、斑竹、唐竹、毛腳龍竹和茶竿竹的竹筍蛋白到達一定濃度后對細胞增殖的抑制作用趨于平緩。

2.3 不同濃度竹筍蛋白對結腸癌細胞株HCT-116細胞增殖的抑制作用

將不同濃度竹筍蛋白作用于結腸癌細胞株HCT-116 72 h后，CCK-8法檢測細胞增殖情況，結果如圖2所示，12種竹筍蛋白中均可抑制結腸癌細胞株HCT-116的增殖，在一定濃度范圍內，濃度越高抑制作用越明顯;其中綠皮黃筋竹、撐綠竹3號、粉單竹、黃麻竹、吊絲單竹、馬來甜龍竹和勃氏甜龍竹的竹筍蛋白濃度與細胞增殖抑制率呈正相關，呈現一定的劑量-效應關系;而桂竹、斑竹、唐竹、毛腳龍竹和茶竿竹的竹筍蛋白到達一定濃度后抑制結腸癌細胞株HCT-116的增殖作用趨于平緩。

2.4 12種竹筍蛋白對胃癌細胞SGC-7901和結腸癌細胞HCT-116增殖的影響

在一定濃度范圍內，這12種不同種類的竹筍蛋白均可抑制SGC-7901和HCT-116細胞增殖。為進一步驗證這種抑制作用，將提取的稀釋成不同濃度的12種竹筍蛋白作用于SGC-7901和HCT-116細胞株72 h后，采用光學倒置顯微鏡觀察細胞的生長情況，加以驗證其對腫瘤細胞增殖活性的影響。

從12種提取的竹筍蛋白原液稀釋5倍后作用于胃癌細胞株SGC-7901培養72 h后顯微鏡下的細胞生長情況（圖3）可以明顯地看到，與CK對照組細胞形態飽滿、結構完整相比，12種竹筍蛋白作用于胃癌細胞株SGC-7901后，細胞數量顯著減少，且大部分細胞形態發生明顯改變，細胞體積縮小，胞核呈致密濃染，失去正常形態，呈半月狀或碎塊狀，表現為典型的細胞凋亡或細胞壞死狀態，尤其桂竹、斑竹、唐竹、毛腳龍竹和茶竿竹，表明12種竹筍蛋白原液稀釋5倍后均可抑制胃癌細胞株SGC-7901的增殖，與CCK-8的檢測結果一致。

從12種竹筍蛋白原液稀釋5倍后作用于結腸癌細胞株HCT-116培養72 h后顯微鏡下的細胞生長情況（圖4）可以看出，與CK對照組相比，12種竹筍蛋白作用于結腸癌細胞株HCT-116后，細胞數量顯著減少，且細胞形態發生明顯改變，細胞體積縮小，形態改變或細胞破碎，尤其桂竹、斑竹、唐竹、毛腳龍竹和茶竿竹作用組表現出典型的細胞壞死狀態，表明12種提取的竹筍蛋白原液稀釋5倍后均可抑制結腸癌細胞株HCT-116的增殖，與CCK-8的檢測結果一致。

2.5 12種竹筍蛋白對胃癌細胞SGC-7901和結腸癌細胞HCT-116的半數抑制濃度

根據各不同梯度濃度的竹筍蛋白作用于腫瘤細胞的不同增殖抑制率，采用GraphPad Prism 軟件，計算IC50值，見表2。IC50值作為抑制能力的最終指標，一般認為，IC50值若2 ?mg/mL< 85%，則視為無效;若2 ?mg/mL≥85%或1 ?mg/mL>50%，視為弱效;若1 ?mg/mL≥85%或0.5 ?mg/mL>50%，則為強效抑制[11]。IC50的數值越小，說明其抑制腫瘤細胞增殖的作用越強。由表2可知，12種竹筍蛋白對胃癌細胞株SGC-7901和結腸癌細胞株HCT-116增殖的抑制作用都屬于強效的;對胃癌細胞株SGC-7901抑制作用最強的是唐竹，其次是桂竹，然后依次是茶竿竹、斑竹、毛腳龍竹、吊絲單竹、馬來甜龍竹、綠皮黃筋竹、粉單竹、黃麻竹、撐綠竹3號，抑制作用最弱的是勃氏甜龍竹。對結腸癌細胞株HCT-116抑制作用最強的是毛腳龍竹，其次是桂竹，然后依次是斑竹、唐竹、茶竿竹、馬來甜龍竹、吊絲單竹、黃麻竹、撐綠竹3號、勃氏甜龍竹、綠皮黃筋竹，抑制作用最弱的是粉單竹。對胃癌細胞株SGC-7901和結腸癌細胞株HCT-116的增殖抑制作用均較強的竹種是桂竹、唐竹、毛腳龍竹、斑竹和茶竿竹。其他竹種的竹筍蛋白對這2種腫瘤細胞增殖的抑制作用并無呈現出一定的種屬特異性規律。

3 結論與討論

12種竹筍蛋白對胃癌細胞株SGC-7901和結腸癌細胞株HCT-116的體外增殖均具有顯著的且強效的抑制作用，即具有抗癌活性。對胃癌細胞株SGC-7901抑制作用最強的是唐竹，其次是桂竹;對結腸癌細胞株HCT-116抑制作用最強的是毛腳龍竹，其次是桂竹;同時對胃癌細胞株SGC-7901和結腸癌細胞株HCT-116增殖的抑制作用表現均出色的是桂竹、唐竹、毛腳龍竹、斑竹和茶竿竹。

同一種竹筍蛋白對胃癌細胞株SGC-7901和結腸癌細胞株HCT-116的增殖抑制率不完全相同，并與竹筍蛋白的濃度密切相關。在一定濃度范圍內，蛋白濃度越高其抑制腫瘤細胞增殖的作用越明顯，即竹筍蛋白濃度與細胞增殖抑制率成正比，呈現一定的劑量依賴關系。而一些竹筍蛋白，如桂竹、斑竹、唐竹、毛腳龍竹和茶竿竹等在到達一定濃度后其抑制腫瘤細胞的增殖作用趨于平緩。

該研究中竹筍蛋白對人胃癌細胞SGC-7901和結腸癌細胞HCT-116的增殖都具有強效的抑制作用。一般認為，腫瘤藥物敏感試驗的體外試驗結果與體內化療療效總符合率達85%[12]，但仍需進一步對竹筍蛋白進行體內的抗腫瘤活性評價以及活性成分分析，確定其有效物質成分。另外，該研究僅僅探討了這12種竹筍蛋白對人胃癌細胞SGC-7901和結腸癌細胞HCT-116體外增殖的抑制作用，其對其他癌細胞株的增殖是否具有抑制作用尚不明確，以及其抑制細胞增殖的作用機制也不清楚，后續研究將進一步探討這些問題。

參考文獻

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