響應面法優化小球藻超聲波破壁技術

郭鎖蓮 廉想 于雪

摘要 小球藻營養豐富且全面，具有重要的生理功能和保健功效，在營養品、保健品、功能食品方面具有良好的應用前景。然而，由于小球藻的細胞壁十分堅硬，破碎困難，胞內的有效成分不易釋放，抑制了其產業化發展。因此，一種安全有效的破壁方法是小球藻產業化發展的關鍵。該研究采用超聲波破壁技術處理小球藻，通過單因素試驗考察超聲時間、超聲波功率、料液比對細胞破碎的影響，并進一步采用Box-Behnken 試驗設計和響應面分析法優化其工藝參數。結果表明：通過單因素試驗得到破壁效果的影響力大小依次為超聲時間、超聲波功率、料液比。Design-Expert 8.0.6軟件優化的工藝條件為料液比1∶200（g∶mL）、超聲波功率為450 W、超聲時間為15 min。該條件下細胞破壁率為79.51%，與模型預測值80%非常接近。采用響應面法對超聲波破碎藻細胞條件進行優化合理可行。

關鍵詞 小球藻;超聲波;破壁;響應面法

中圖分類號 S-3 ? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）12-0178-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.049

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract Chlorella has been applied in many fields，for its rich，allround and balanced nutrition.The cell wall of Chlorella is very hard to crush，so that the activate component in the cell is difficult to release.Then，industrialization development for Chlorella is restricted.Therefore，a safety and effective method to break cell is the key technology in Chlorella industry.Ultrasound technology was adopted to break Chlorella cell in this study.In order to obtain the optimum parameters of ultrasound technology，the effects of several factors including solidliquid ratio，ultrasonic power and process time on the breaking were investigated by using a single factor experiment and further optimized by using BoxBehnken experiment and response surface methodology （RSM）.The results showed that process time had the most important influence on cellbreakage and it was followed by ultrasonic power ，solidliquid radio in the effects.The optimal condition of cellbreakage was obtained，that was，solidtoliquid ratio of 1∶200，ultrasonic power of 450 W and process time of 15 min.The cell breaking rate was 79.51% under those conditions，which perfectly matched the predicted value （80%）.Therefore，it is feasible that utilizing RSM to optimize the conditions of cellbreakage.

Key words Chlorella sp.;Ultrasound wave;Cellbreakage;Response surface methodology

小球藻（Chlorella sp.）隸屬于綠藻綱綠球目卵囊藻科小球藻屬，是普生性真核單細胞綠藻。小球藻營光合自養，是初級生產力，處于食物鏈的最低端，具有分布廣泛[1]、生長周期短、繁殖快等優點，成為第一種被人工養殖的微藻，在美國、日本等國已有30多年的養殖歷史[2]。

小球藻營養豐富，胞內富含蛋白質、不飽和脂肪酸、色素和維生素，其中必需氨基酸、必需脂肪酸的組成全面，配比均衡，且無毒副作用，作為保健食品、水產養殖餌料、畜牧飼料添加劑得到廣泛應用[3-4]。不僅如此，小球藻在污水處理[5-6]、CO2減排[7]，以及生物能源[8-9]的開發利用方面都在世界范圍內引起了廣泛重視。

小球藻因其結構簡單、生長迅速、無毒害作用，被認為是開展生物技術研究的良好材料[10]，它可以作為生物反應器生產藥物等基因工程產品[11]。但是由于小球藻細胞壁成分復雜，質地堅韌[12]，給胞內有效成分的獲取造成了一定的困難，從而影響了小球藻相關產品的應用和推廣 [13-14]。

為了尋找一種安全有效的破壁方法，筆者主要通過超聲波破碎技術對小球藻進行破壁處理，考察了單因素料液比、超聲時間和超聲功率對破壁效果的影響。通過響應曲面模型對小球藻的超聲波破壁工藝進行優化，旨在尋找最佳的操作條件。

1 材料與方法

1.1 材料 小球藻藻種，由煙臺富生科技有限公司提供。

1.2 設備與儀器 生物顯微鏡（上海長方光學儀器有限公司）;分析電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司];Scientz-IID超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗。

固定條件：超聲波功率為500 W，處理時間20 min，料液比1∶200 （g∶mL），改變單一因素，考察其對小球藻細胞破碎率的影響，每組試驗重復3 次，取平均值。

破碎率=[（原始細胞個數-破碎處理后剩余的細胞個數）/原始細胞個數]×100%

1.3.2 響應面法優化超聲破壁技術。

根據Box-Behnken 中心組合試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，選取3因素3水平試驗對提取條件進行優化，試驗因素和水平見表1，每組試驗重復3 次，取平均值。針對得到的數據進行分析，利用Design-Expert 8.0.6 軟件優化工藝條件，確定最優的料液比、超聲功率、超聲時間。

2 結果與分析

2.1 超聲破壁影響因素確定

2.1.1 超聲時間對細胞破碎率的影響。

固定料液比、超聲波功率等條件，研究不同超聲時間對細胞破碎率的影響。超聲時間由3 min延長到15 min時破碎率從3%上升到76%，延長超聲處理時間，細胞膜上會產生更多的孔洞，細胞更容易破碎，進而導致細胞破碎率增加（圖1）。當超聲處理時間超過15 min后，破壁率維持在75%左右，并沒有明顯提高，綜合能耗和經濟效率的角度考慮，采用超聲時間15 min進行超聲處理。

2.1.2 超聲波功率對細胞破碎率的影響。

固定料液比、超聲時間等條件，研究不同超聲波功率對細胞破碎率的影響。超聲波功率由300 W升到450 W時細胞破碎率由50%增加到73%（圖2）。在劉圣臣等[15]的研究中也呈現同樣趨勢。其可能原因是由于超聲波導致細胞膜表面及周圍的空化氣泡破裂，隨著功率的增大，會產生大量的裂縫及孔洞，進而使細胞壁破碎率增大[14]。但超過400 W繼續增大功率，藻細胞破壁率增加并不明顯，從經濟和效率方面綜合考慮，采用450 W為最佳功率。

2.1.3 料液比對細胞破碎率的影響。

固定超聲波功率、超聲時間等條件，研究不同料液比對細胞破碎率的影響。該試驗設計1∶50，1∶100，1∶200，…，1∶1 000共7個梯度，結果如圖3所示。當料液比從1∶100減小到1∶1 000時，細胞破碎率先升高后下降;當料液比為1∶200時，細胞破碎率最高，達76%;料液比高于1∶200時液體中藻細胞濃度過高，細胞聚集成團影響超聲破壁效果，破碎率僅有50%左右。隨著水量的增加，當料液比低于1∶200之后藻細胞濃度降低，導致細胞破碎率低，因此，1∶200為超聲破碎時最適合的料液比。

2.2 響應面法對超聲破碎方法進行優化

根據表2 的結果，用Design-Expert 8.0.6 軟件進行方差分析。從方差分析結果可知，試驗所選模型極顯著（P<0.01）;一次項中超聲時間（A）和超聲波功率（B）對細胞破碎率的影響達極顯著（P<0.000 1），料液比（C）對細胞破碎率的影響為顯著（P<0.05）;二次項中超聲時間（A）、超聲波功率（B）、料液比（C） 對細胞破碎率的影響均為極顯著（P<0.01）;交互項中AB、AC 影響為顯著（P<0.05），而BC 影響不顯著，可以看出各因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，影響程度從大到小依次為超聲時間（A）、超聲波功率（B）、料液比（C）。

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2的數據進行回歸分析，得三元二次回歸方程：

Y=80.00+3.25A+1.13B-0.38C+0.25AB+0.25AC-2.75A2-1.00B2 -10.50C2

用Design-Expert 8.0.6 軟件分析模型的可信度，模型的決定系數R2=0.999 6，R2adj=0.999 1，其中R2越接近1，表明模型預測的響應值越準確，可用于試驗分析和預測。模型變異系數C.V.% = 0.26 < 10，變異系數反映試驗的可重復性，其值越小表明試驗越精確。模型信噪比Adeq Precision=19.360>4，表明模型的相應信號足夠強，模型可信并可用于擬合試驗結果。綜上分析，該模型可用于分析預測超聲波破壁技術工藝。

根據回歸分析結果做響應曲面圖，分析超聲時間、超聲波功率、料液比三者之間交互作用對細胞破碎率的影響，其響應曲面如圖4～6所示。

通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析得出，小球藻破碎最佳提取條件為料液比1∶200、超聲波功率為450 W、超聲時間15 min，該條件下細胞破碎率最高，為80%。按最優組合方案中的提取條件進行驗證試驗，得到的藻細胞破碎率為（79.51±0.19）% （n=3），和預測值吻合較好，相對誤差約為0.61%，表明該回歸模型與驗證試驗結果吻合良好，回歸方程能真實地反映超聲時間、超聲波功率、料液比對藻細胞破碎率的影響，模型工藝參數準確可靠，能較好地預測實際情況。

3 結論

該試驗研究了超聲波破碎藻細胞的最佳工藝，在單因素試驗的基礎上，通過響應面法優化了超聲波破壁工藝，得到如下結論。

（1）建立了一個以小球藻破碎率為目標值，料液比、超聲波功率、超聲時間為因子的數學模型：Y=80.00+3.25A+1.13B-0.38C+0.25AB+0.25AC-2.75A2-1.00B2-10.50C2，采用此模型在該試驗范圍內能較準確地預測小球藻的破碎率。

（2）通過試驗結果的方差分析可知，在該試驗范圍內，各因素對小球藻破碎率的影響順序依次為超聲時間、超聲波功率、料液比。

（3）小球藻超聲波破碎率的工藝參數為料液比1∶200、超聲波功率450 W、超聲時間15 min，在此優化工藝條件下，實際測得的小球藻破碎率為79.51%。

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