應(yīng)用RAPD標(biāo)記檢測(cè)淮山種質(zhì)資源的遺傳多樣性

蔡錦玲 凌永勝 林文磊

摘要 采用RAPD標(biāo)記對(duì)7份德化淮山種質(zhì)進(jìn)行遺傳多態(tài)性和遺傳距離分析，并構(gòu)建聚類圖。從63個(gè)RAPD引物中篩出31個(gè)多態(tài)性較好的組合，擴(kuò)增得到了156個(gè)多態(tài)性標(biāo)記。結(jié)果表明，7份淮山種質(zhì)依據(jù)遺傳距離可分為2類，組間的遺傳距離為0.32，其中，大銘薯、泉淮1513和泉淮1547的親緣關(guān)系較近，組內(nèi)的平均遺傳距離為0.21，另一類組內(nèi)的平均遺傳距離為0.44。對(duì)照田間表型可見(jiàn)，聚類結(jié)果相近于傳統(tǒng)分類結(jié)果。利用RAPD標(biāo)記能有效地分析淮山的遺傳多樣性，對(duì)雜交優(yōu)勢(shì)的利用具有較大的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞 淮山;種質(zhì)資源;RAPD;遺傳多樣性;聚類分析

中圖分類號(hào) S 632.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）12-0120-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.032

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract To analyze the genetic polymorphism and genetic distance of 7 Dehua Dioscorea opposita germplasm by RAPD markers，and build the cluster diagram，31 combinations with good polymorphism were screened out from 63 RAPD primers，and 156 polymorphic markers were amplified.The results showed that 7 D. opposita germplasms could be divided into two groups according to genetic distance，and the genetic distance between groups was 0.32.Among them，Damingshu，Quanhuai 1513 and Quanhuai 1547 were closely related，with an average genetic distance of 0.21 in the group，the mean genetic distance in the other group was 0.44.Compared with the field phenotype，the clustering results were similar to the traditional classification results.The genetic diversity of D. opposita can be effectively analyzed by RAPD markers，which is of great guiding significance for the utilization of hybridization.

Key words Dioscorea opposita Thunb.;Germplasm resources;RAPD;Genetic diversity;Cluster analysis

淮山屬于薯蕷科植物薯蕷（Dioscorea opposita Thunb.）的塊狀根莖，為纏繞性藤本植物[1]，是集醫(yī)用、養(yǎng)生、保健、食用、飼用于一身的一種高效率經(jīng)濟(jì)作物，其肉質(zhì)鮮美，風(fēng)味特別，具有滋補(bǔ)脾胃肺腎，增強(qiáng)人體免疫能力，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，抗氧化活性等作用[2]?；瓷皆谖覈?guó)的栽培歷史已有2 000 余年，原產(chǎn)于我國(guó)沿海地區(qū)及東南亞一帶，現(xiàn)今在全國(guó)各地均有種植[3]。由于其栽培歷史長(zhǎng)、地域廣，在栽培生產(chǎn)和銷售市場(chǎng)上一直存在同名異種和同種異名的狀況，使得淮山種質(zhì)資源的推廣與開發(fā)更為艱難。目前國(guó)內(nèi)尚未統(tǒng)一淮山“種”以下第一階梯的分類標(biāo)準(zhǔn)，因此淮山種質(zhì)資源的鑒別不僅有利于其開發(fā)利用，而且可為遺傳育種提供理論支撐。

近年來(lái)，DNA分子標(biāo)記技術(shù)相繼出現(xiàn)，如RAPD、RFLP、SSR以及SNP等，其中隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記RAPD（random amplified polymorphic DNA）具有操作方便和多態(tài)性檢測(cè)率高等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于材料鑒定、系譜親緣及進(jìn)化關(guān)系的研究[4]。如李明軍等[5]優(yōu)化了山藥基因組RAPD分子標(biāo)記技術(shù)方案;華樹妹等[6]采用RAPD分子標(biāo)記分析了福建省34份山藥遺傳多樣性;黃春洪等[7]使用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)國(guó)內(nèi)11個(gè)盾葉薯蕷居群的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了研究;同時(shí)國(guó)外也報(bào)道了利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建山藥的遺傳圖譜[8]。筆者擬用RAPD分子標(biāo)記研究分析7個(gè)淮山種質(zhì)資源的遺傳多樣性，以期為淮山遺傳育種和雜種優(yōu)勢(shì)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇來(lái)自德化的7份淮山種質(zhì)資源為供試材料，其中德化本土品種2個(gè)（下涌薯、大銘薯），新品系5個(gè)（

泉淮紅皮白肉、泉淮1515、泉淮1517、泉淮1513、泉淮1547）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取。參照Saghai-Maroof等[9]方法，采用CTAB小樣法提取山藥幼葉基因組總DNA。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系。RAPD引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，共合成了63個(gè)引物。反應(yīng)體系參考華樹妹等[6]的優(yōu)化體系進(jìn)行。采用20 μL PCR體系：模板DNA （20 ng/μL）1 μL，10×Easy Taq Buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.4 μL，引物（10 μmol/L）0.2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，37 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，40個(gè)循環(huán);循環(huán)結(jié)束后在72 ℃的反應(yīng)條件下延伸10 min。反應(yīng)終止后4 ℃保存，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用l %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 標(biāo)記采集。統(tǒng)計(jì)各樣本的RAPD擴(kuò)增條帶（有帶讀1，沒(méi)有帶讀0，只讀有多態(tài)性的標(biāo)記）。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理。2個(gè)樣本X與Y之間遺傳距離的計(jì)算參照Nei等[10]提供的計(jì)算公式：GDxy =1-2Nxy/（Nx+Ny），其中，Nxy為樣本X與Y所共有的帶;Nx為X樣本所有的帶;Ny為Y樣本所有的帶[10]。組內(nèi)平均遺傳距離取組內(nèi)材料間遺傳距離的平均值;組間平均遺傳距離取不同組間材料遺傳距離的平均值;材料平均遺傳距離為某一材料與其他所有供試材料遺傳距離的平均值。用非加權(quán)平均法（UPGMA）構(gòu)建材料間的聚類圖。遺傳距離的計(jì)算和聚類圖的構(gòu)建采用R軟件包[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 淮山種質(zhì)資源分析評(píng)價(jià)

調(diào)查顯示，泉淮1517、下涌薯、泉淮1515和泉淮紅皮白肉長(zhǎng)勢(shì)旺盛，莖蔓棱翼四棱形，葉片較大、厚紙質(zhì)，葉柄長(zhǎng)，葉基出脈數(shù)均為7條，無(wú)零余子。泉淮1513、泉淮1547和大銘薯的莖蔓棱翼圓形，葉片中等、薄革質(zhì)，葉柄較短，有較多橢圓形或長(zhǎng)橢圓形的零余子。其中，下涌薯中熟，產(chǎn)量一般，粗多糖等品質(zhì)成分含量較高，商品性差，中感炭疽病;泉淮紅皮白肉中熟，豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)性好，品質(zhì)成分含量較高，較抗炭疽病;泉淮1515中熟，豐產(chǎn)又穩(wěn)產(chǎn)，品質(zhì)成分含量一般，中感炭疽病;泉淮1517中熟，豐產(chǎn)性好但穩(wěn)產(chǎn)性差，品質(zhì)成分含量一般，商品性差，中抗炭疽病;大銘薯中晚熟，產(chǎn)量較低，品質(zhì)成分含量較低，抗炭疽病;泉淮1513中晚熟，產(chǎn)量低，品質(zhì)成分含量較低，抗炭疽病;泉淮1547中晚熟，豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)性較好，品質(zhì)成分含量較高，商品率高，抗炭疽病。

2.2 RAPD標(biāo)記的多態(tài)性

從63個(gè)RAPD引物中篩選出31個(gè)多態(tài)性較好的引物對(duì)7個(gè)淮山種質(zhì)資源進(jìn)行分析，片段長(zhǎng)度在200～2 000 kb。一共得到156個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，平均每個(gè)引物5.03個(gè)，引物擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)最多達(dá)10個(gè)。表1為31個(gè)隨機(jī)引物的引物編號(hào)及序列，圖1是RAPD引物A-20電泳結(jié)果。

2.3 遺傳距離分析

RAPD標(biāo)記計(jì)算的各淮山種質(zhì)資源之間的平均遺傳距離為0.37～0.49，總平均遺傳距離為0.45（表2）。依據(jù)遺傳距離的大小，分為2類，組間的遺傳距離為0.32，第一類群的平均遺傳距離為0.44， 較第二類群的平均遺傳距離（0.21）遠(yuǎn)，說(shuō)明第一類群的淮山種質(zhì)遺傳多樣性大;其中，泉淮紅皮白肉的平均遺傳距離0.49為最大，泉淮1547的平均遺傳距離最小，僅為0.37，說(shuō)明泉淮紅皮白肉具備較為豐富的遺傳變異性。

2.4 聚類分析

應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記對(duì)7份淮山種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示：下涌薯、泉淮紅皮白肉、泉淮1515和泉淮1517品種間具有較大的遺傳相似性，聚在了同一類;大銘薯、泉淮1513和泉淮1547的遺傳相似性接近，單獨(dú)成一類。聚類結(jié)果和遺傳距離的結(jié)果相一致，說(shuō)明通過(guò)這兩大類群間雜交選育可獲得更高的遺傳變異。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

作為研究作物種質(zhì)資源親緣關(guān)系的一項(xiàng)技術(shù)，RAPD標(biāo)記具有檢測(cè)容易、靈敏度高、引物無(wú)種屬界限等特點(diǎn)，因此較其他鑒定技術(shù)如同工酶鑒定技術(shù)等更為有效。同時(shí)，與其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)一樣，RAPD標(biāo)記容易受PCR反應(yīng)體系中各組分濃度以及PCR儀器性能等因素的影響產(chǎn)生假帶，穩(wěn)定性也相對(duì)較差。因此，需要摸索其合適的反應(yīng)條件，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果反復(fù)驗(yàn)證。

該研究通過(guò)RAPD方法測(cè)定了來(lái)源不同的7個(gè)淮山種質(zhì)資源，得到的聚類結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類結(jié)果有一定的一致性。聚類結(jié)果將7個(gè)淮山種質(zhì)資源在平均遺傳距離指數(shù)為0.45處分為A和B共2組，A組中的泉淮紅皮白肉和泉淮1517在產(chǎn)量上較下涌薯與泉淮1515高，與聚類分析中顯示出的泉淮紅皮白肉和泉淮1517遺傳距離較遠(yuǎn)結(jié)果相一致;B組中的大銘薯、泉淮1513和泉淮1547在葉形、莖蔓形態(tài)和產(chǎn)量等方面相接近，在傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類上可以分為同一類。可見(jiàn)，供試的7個(gè)淮山種質(zhì)資源遺傳親緣關(guān)系與其產(chǎn)量存在一定相關(guān)性，詳細(xì)情況可待進(jìn)一步研討。

3.2 結(jié)論

RAPD分子標(biāo)記在淮山的遺傳多樣性分析中具有較高的多態(tài)性，能夠幫助研究者在基因組的DNA水平上掌握其多樣性，可嘗試選擇遺傳距離較遠(yuǎn)的親本進(jìn)行配組雜交，獲得遺傳變異豐富的后代材料。該研究結(jié)果表明：泉淮紅皮白肉與其他供試淮山種質(zhì)資源存在大的遺傳距離，具有較大的遺傳變異，通過(guò)配組雜交，較容易獲得綜合性狀好的后代材料;而大銘薯、泉淮1513和泉淮1547的遺傳多樣性較低，應(yīng)該優(yōu)先考慮與類群外的親本材料配組雜交，才能進(jìn)一步擴(kuò)大其遺傳多態(tài)性。

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