豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1α多克隆抗體的制備及應(yīng)用

趙慧君 趙旭陽(yáng) 史西保

摘要 以真核質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-nsp1α為模板，利用PCR擴(kuò)增出nsp1α基因片段，構(gòu)建原核重組載體pET32a-nsp1α，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，1 mmol/L IPTG在37 ?℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，成功獲得以包涵體形式存在的重組蛋白，能夠與小鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體反應(yīng);包涵體復(fù)性后作為抗原免疫新西蘭大白兔，3次免疫后20 d獲得兔多抗血清。通過間接ELISA、Western blot、間接免疫熒光、免疫組化等試驗(yàn)獲得了高效價(jià)的兔多抗血清，該血清能夠特異性地識(shí)別真核質(zhì)粒表達(dá)的nsp1α以及PRRSV BJ4株。該試驗(yàn)成功表達(dá)了pET32a-nsp1α重組蛋白，并制備了高效價(jià)、高特異性的兔抗nsp1α多克隆抗體。

關(guān)鍵詞 PRRSV;nsp1α;多克隆抗體

中圖分類號(hào) S 852.65+1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）12-0115-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.031

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract Using eukaryotic plasmid pcDNA3.1flagnsp1α as a template，nsp1α gene fragment was amplified by PCR.The prokaryotic recombinant vector pET32ansp1α was constructed and transformed the pET32ansp1α into receptor state of Escherichia coli cells BL21 （DE3） to express the nsp1α by adding 1 mmol/L IPTG at 37 ℃.The recombinant protein nsp1α was obtained in the form of inclusion body ，which could react with His tag monoclonal antibody.The inclusion bodies after renaturation was used as antigen to immunize New Zealand white rabbit，rabbit polyclonal antiserum was obtained on the 20th day after three times of immunization.The results of ?indirect ELISA，Western blot，indirect immunofluorescence，immunohistochemistry showed that the rabbit polyclonal antibody with high titer were obtained，which could specifically identify nsp1α expressed by eukaryotic plasmid and BJ4 strains of PRRSV.The recombinant protein pET32ansp1α was successfully expressed，highspecificity rabbit antinsp1α polyclonal antibody with high tier was prepared.

Key words PRRSV;nsp1α;Polyclonal antibody

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）能夠引起豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），也稱“藍(lán)耳病”，其主要特征是母豬嚴(yán)重的繁殖障礙以及仔豬出現(xiàn)呼吸困難。該病自1987年在美國(guó)報(bào)道以來(lái)，已經(jīng)蔓延至全球主要的養(yǎng)豬國(guó)家，是造成養(yǎng)豬業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的主要疫病之一[1-2]。1996年郭寶清等[3]

從流產(chǎn)的豬胎兒中分離出PRRSV病毒，證實(shí)了我國(guó)也存在豬繁殖與呼吸綜合征。2006年我國(guó)南方暴發(fā)由變異的PRRSV引起的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，混合感染其他病原（如豬圓環(huán)病毒、豬鏈球菌、豬肺支原體等），造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。因此，研究PRRSV的致病機(jī)理，建立有針對(duì)性的防控措施對(duì)于養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展意義重大。

PRRSV基因組編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的開放閱讀框約占基因組全長(zhǎng)的80%，首先翻譯為包含所有非結(jié)構(gòu)蛋白的多聚蛋白前體，nsp1α具有類木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶活性，能夠自我切割，從多聚蛋白上分離出來(lái)[6];同時(shí)，它還能抑制干擾素，對(duì)PRRSV逃逸宿主免疫機(jī)制具有重要的作用[7]。目前市場(chǎng)上尚無(wú)商品化的nsp1α抗體，筆者利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備nsp1α的重組蛋白，免疫動(dòng)物后獲得抗nsp1α的多克隆抗體，可以用于檢測(cè)PRRSV的感染情況，也為nsp1α的進(jìn)一步研究提供了有用的試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和毒株

真核質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-nsp1α、pcDNA3.1-flag、原核質(zhì)粒pET32a由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;PRRSV BJ-4株由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)楊漢春教授惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

Ex Taq酶、核酸膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ、pMD18T載體、T4連接酶、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自TaKaRa公司;質(zhì)粒回收試劑盒購(gòu)自杭州愛思進(jìn)生物公司;IPTG和氨芐霉素購(gòu)自索萊寶生物公司;小鼠抗His標(biāo)簽IgG購(gòu)自Proteintech公司;小鼠抗flag標(biāo)簽IgG、HRP-羊抗兔IgG、FITC-羊抗兔IgG均購(gòu)自Abbkine公司;AEC酶底物試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物公司;Lipofectamaine2000購(gòu)自Invitrogen生物試劑公司;其他常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 方法

1.3.1 擴(kuò)增nsp1α基因片段。

以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的真核質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-nsp1α為模板，設(shè)計(jì)nsp1α（540 bp）上游引物：5GAATTCATGTCTGGGATACTTGATCGGTGCA3（下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物5AAGCTTCATAGCACACTCAAAGGGGCAAAAGT3（下劃線為HindⅢ酶切位點(diǎn)），由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃5 min;94 ℃30 s，55 ℃30 s;72 ℃90 s，94 ℃30 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃10 min;等溫度降至16 ℃后，110 V電壓下電泳30 min，使用凝膠成像儀拍照后切取目的基因片段回收。

1.3.2 原核重組質(zhì)粒pET32a-nsp1α的構(gòu)建。

nsp1α基因片段和質(zhì)粒pET32a同時(shí)用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切，37 ℃水浴3 h，核酸電泳并切膠回收目的片段，T4連接酶16 ℃水浴連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板氨芐抗性平皿12 h后，挑取單菌落到氨芐抗性LB培養(yǎng)基中，待菌液渾濁后PCR鑒定，陽(yáng)性結(jié)果的菌液提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定陽(yáng)性后送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.3.3 重組蛋白pET32a-nsp1α的表達(dá)及Western blot試驗(yàn)。

取上述鑒定的pET32a-nsp1α重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落加入氨芐抗性LB培養(yǎng)基搖菌，待菌液渾濁后按1∶100取適量菌液加入新鮮的LB培養(yǎng)基繼續(xù)搖菌。當(dāng)OD600 nm為0.6左右時(shí)，取1 mL菌液作為對(duì)照，添加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，分別在誘導(dǎo)1、2、4、6、8 h取1 mL菌液，12 000 r/min離心菌液1 min后棄上清，加600 μLPBS重懸;其中將誘導(dǎo)2、4 h收集的菌液重懸后超聲破碎5 min，1 200 r/min離心1 min后吸出上清，沉淀用600 μL PBS重懸;將上述收集的樣品加入5×SDS上樣緩沖液稀釋后，100 ℃水浴7 min左右，加樣15 μL SDS-PAGE電泳。同時(shí)，取0 h和6 h樣品進(jìn)行Western blot鑒定，蛋白質(zhì)電泳結(jié)束后，半干式轉(zhuǎn)膜儀15 V電壓轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶4 ℃封閉過夜;PBST洗滌后加1∶1 000倍稀釋的小鼠抗His標(biāo)簽IgG，37 ℃孵育1 h;PBST洗滌后，1∶2 000倍稀釋的HRP-羊抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h;PBST洗滌后AEC顯色。

1.3.4 重組蛋白pET32a-nsp1α的制備。

取新鮮的含pET32a-nsp1α重組質(zhì)粒的菌液按1∶100加入200 mL氨芐抗性LB培養(yǎng)基中，按照步驟“1.3.3”探索的最佳表達(dá)條件誘導(dǎo)。然后，菌液8 000 r/min離心20 min，棄上清，加入緩沖液A（0.88 g NaCl、0.121 g Tris、0.292 g EDTA、0.03 g DTT，再加入PMSF使終濃度達(dá)到0.5 mmol/L，單蒸水定容至100 mL，調(diào)節(jié)pH為8.0，4 ℃下保存）20 mL，重懸后在冰水中放置10 min，超聲破碎20 min;8 000 r/min離心20 min后收集上清，沉淀用緩沖液B（0.58 g NaCl、0.292 g EDTA、0.6 g Tris、0.03 g DTT，加入TritonX-100使終濃度達(dá)到1%，單蒸水定容至100 mL，再調(diào)節(jié)pH為8.0，4 ℃下保存）重懸，超聲破碎2 min后8 000 r/min離心20 min，收集上清，加緩沖液B重復(fù)這一步驟;加2 mol/L尿素緩沖液（2.9 g NaCl、0.3 g Tris、0.145 g EDTA、0.015 g DTT、12 g尿素，單蒸水定容至100 mL，調(diào)節(jié)pH至8.0，4 ℃保存）20 mL重懸沉淀，超聲破碎2 min后8 000 r/min離心20 min，收集上清;加8 mol/L尿素緩沖液（2.9 g NaCl、0.3 g Tris、0.145 g EDTA、0.015 g DTT、48 g尿素，單蒸水定容至100 mL，調(diào)節(jié)pH至8.0、4 ℃保存）20 mL，冰水中放置30 min，8 000 r/min離心10 min，收集上清即為重組蛋白的包涵體變性液[8]。將復(fù)性液裝入已處理好的透析袋中，置于透析緩沖液，在4 ℃磁力攪拌進(jìn)行梯度透析，緩沖液中尿素濃度依次遞減至7、6、5、4、3、2、1、0.5和0 mol/L，每次換液間隔約6 h。最后，將透析袋中復(fù)性液4 ℃4 000 r/min離心5 min，取上清液保存。

1.3.5 多克隆抗體的制備及ELISA效價(jià)檢測(cè)。

選取3只2月齡的新西蘭大白兔，耳靜脈采血作為陰性對(duì)照。將復(fù)性后的重組蛋白pET32a-nsp1α與弗氏完全佐劑乳化后背部多點(diǎn)注射，每只兔子免疫重組蛋白約350 μg;21 d后用等體積弗氏不完全佐劑乳化重組蛋白，免疫方式及劑量同首免。三免后20 d心臟采血，37 ℃放置30 min后，4 ℃放置過夜，收集析出的上清。4 000 r/min離心5 min，取上清即為兔抗nsp1α多克隆抗體血清，分裝后-40 ℃下保存。以復(fù)性的重組蛋白包板，間接ELISA檢測(cè)血清效價(jià)。用CBS將重組蛋白稀釋至10 ng/μL，50 μL/孔包被酶標(biāo)板后在4 ℃下放置過夜，PBST洗滌3次后每孔加5%脫脂奶200 μL在37 ℃放置2 h;PBST洗滌3次，兔血清用5%脫脂奶從500倍稀釋開始以2倍倍比稀釋到8 192 000倍，每孔加樣50 μL，3個(gè)重復(fù)，設(shè)置陰性血清對(duì)照、空白孔對(duì)照等，37 ℃作用50 min;PBST洗滌3次，HRP-羊抗兔IgG用5%脫脂奶1∶4 000倍稀釋后每孔加50 μL，37 ℃作用50 min;PBST洗滌3次，加入TMB顯色液（底物液A為四甲基聯(lián)苯胺0.2 g，無(wú)水乙醇10 ?mL，加雙蒸水定容至100 ?mL;底物液B為磷酸氫二鈉1.46 g，檸檬酸0.933 g，30%過氧化氫0.05 ?mL，雙蒸水定容至100 ?mL，pH 5.0;使用時(shí)底物液A和B按1∶1的比例混合），50 μL/孔，避光顯色5 min后加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng);酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下讀數(shù)，兔血清OD值/陰性血清OD值>2.1（P/N>2.1）的最高稀釋倍數(shù)即為血清效價(jià)。

利用獲得的抗nsp1α多克隆抗體進(jìn)行Western blot、間接免疫熒光、免疫組化等一系列試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了多克隆抗體的特異性和高效價(jià)，也顯示制備的多克隆抗體能識(shí)別真核質(zhì)粒表達(dá)的nsp1α以及PRRSV BJ4株。這為進(jìn)一步研究nsp1α提供了有用的試驗(yàn)材料，并且還能用于檢測(cè)PRRSV的感染情況。

參考文獻(xiàn)

[1]GOYAL S M.Porcine reproductive and respiratory syndrome[J].Journal of veterinary diagnostic investigation，1993，5（4）： 656-664.

[2] WENSVOORT G，TERPSTRA C，POL J M A，et al.Mystery swine disease in the Netherlands： The isolation of Lelystad virus[J].Veterinary quarterly，1991，13（3）： 121-130.

[3] 郭寶清，陳章水，劉文興，等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J].中國(guó)畜禽傳染病，1996（2）： 3-7.

[4] TIAN K H，YU X L，ZHAO T Z，et al.Emergence of fatal PRRSV variants： Unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLoS One，2007，2（6）：e526.

[5] TONG G Z，ZHOU Y J，HAO X F，et al.Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，China[J].Emerging infectious diseases，2007，13（9）：1434-1436.

[6] ZIEBUHR J，SNIJDER E J，GORBALENYA A E.Virusencoded proteinases and proteolytic processing in the Nidovirales[J].Journal of general virology，2000，81（4）：853-879.

[7] SHI X B，ZHANG G P，WANG L，et al.The nonstructural protein 1 papainlike cysteine protease was necessary for porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein 1 to inhibit interferonβ induction[J].DNA and cell biology，2011，30（6）：355-362.

[8] 王寅彪.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5截短蛋白的表達(dá)及其ELISA抗體檢測(cè)方法的初步建立[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[9] TERPE K.Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production：From molecular and biochemical fundamentals to commercial systems[J].Applied microbiology and biotechnology，2006，72（2）：211-222.

[10] 董文博，陳洪棟，郝建國(guó)，等.用于藥用蛋白生產(chǎn)的外源表達(dá)系統(tǒng)[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（4）：793-802.