茶樹遺傳轉化體系研究進展

陳蘭 朱晨 李小楨

摘要 茶樹遺傳轉化技術是指應用重組DNA技術、細胞組織培養技術或種質系統轉化技術，有目的地將外源基因或DNA片段插入到茶樹受體基因組中并使其在后代植株中得以表達的過程，在茶樹遺傳改良、品種選育中發揮重要作用。對茶樹遺傳轉化中受體系統建立、茶樹遺傳轉化方法進行概述，闡述了茶樹遺傳轉化研究重點、方向以及當前茶樹遺傳轉化研究所面臨的轉化效率低和離體再生困難的問題，提出了原位轉化技術在茶樹遺傳轉化中的應用潛力，從而達到優化茶樹遺傳轉化體系的目的。

關鍵詞 遺傳轉化;外植體;農桿菌介導法;基因槍法

中圖分類號 S 571.1 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）12-0014-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.004

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract Genetic transformation technology of Camellia sinensis refers to the process of using recombinant DNA technology，cell tissue culture technology or germplasm system transformation technology to purposely insert a foreign gene or DNA fragment into the recipient genome of Camellia sinensis and express it in the progeny plants.It played an important role in genetic improvement and variety selection of Camellia sinensis.We reviewed the system of receptor regeneration and genetic transformation of Camellia sinensis in vitro，and recent advance in genetic transformation of Camellia sinensis were discussed.And also revealed the problems of low transformation efficiency and difficulty in vitro regeneration of the current genetic transformation research institute of Camellia sinensis.Consequently，planta agrobacterium mediated was proposed to achieve the purpose of optimizing the genetic transformation system of Camellia sinensis.

Key words Genetic transformation;Explant;Agrobacterium mediated;Bombardment mediated

植物遺傳轉化是指應用重組DNA技術、細胞組織培養技術或種質系統轉化技術，有目的地將外源基因或DNA片段插入到受體植物基因組中，并使其在后代植株中得以表達的過程。植物遺傳轉化體系包括3個方面：植物遺傳轉化的受體體系、植物遺傳轉化的方法以及轉基因植株再生和檢測。從20世紀70年代起，植物遺傳轉化技術不斷發展，特定基因能夠根據人們的意愿在植物上得以表達。遺傳轉化技術打破了常規育種的界限，為改良作物、創造新品種的基因工程提供了一條新的途徑，并對提高農業經濟效益提供新的思路[1]。

茶樹[Camellia sinensis （L.） O.Kuntze]屬多年生異花授粉的木本植物，目前茶樹育種的主要方法仍是常規系統育種和雜交育種[2]。但茶樹的生育周期長、自交不親和以及人工授粉成功率低等特性給育種工作帶來很大限制[3]。作為我國重要的農業經濟作物，茶樹基因改良日益受到重視[4-5]。遺傳轉化技術既能縮短優良品種的選育周期形成茶樹的定向育種，又能實現對茶樹抗逆性狀的篩選[6]。通過遺傳轉化技術將目標基因導入茶樹中，培育出高產、優質和抗逆性強的茶樹品種，使茶樹品種按生產和市場的需求方向培育，從而推動茶葉經濟的發展[7]。

1 茶樹受體系統的建立

建立良好的受體系統是茶樹遺傳轉化的重要基礎。茶樹受體系統的建立包括外植體的選擇及外植體的消毒、培養基的選擇、植物激素和外源添加物的選擇、外植體褐化和調控等影響因素。

1.1 外植體的選擇 選擇適宜的外植體是受體系統建立的關鍵，茶樹外植體常見的培養方式有器官培養和愈傷組織培養，此外茶樹品種、外植體的生長狀態對外植體的選擇也有一定的影響。

茶樹的子葉和莖段在器官培養中再生能力優于茶樹其它器官。茶樹子葉多用于誘導體胚，Mondal等[8]以子葉誘導的體胚作為轉化受體，首次獲得茶樹的轉基因植株;Saini等[9]和Lv等[10]相繼用子葉誘導體胚進行茶樹遺傳轉化，也獲得了轉基因植株。利用茶樹子葉進行遺傳轉化成功率較高，但也存在缺點，表現為部分優良的茶樹品種不易產生種子，或子葉是雜合體，遺傳背景與母體之間存在較大差異;子葉的離體培養和遺傳轉化需要較長時間，Mondal等[8]建立的轉化體系至少需要490 d。為了保持優質、穩定的遺傳背景，Sandal等[11]認為茶樹遺傳轉化的受體采用茶樹葉片優于子葉，但茶樹葉片的離體成活率僅0～7.1%[12]。而茶樹莖段在茶樹遺傳轉化具有很大的潛力，在茶樹莖段培養中，要選擇有一定成熟度、富含營養成分的莖段，有研究表明取第二腋芽的莖段為外植體，萌芽率最高[13]。

茶樹愈傷組織也是遺傳轉化中應用較多的受體材料，不同外植體所需誘導愈傷組織的時間不同，花藥誘導愈傷組織的時間為7～l0 d，子葉和根需要8～12 d，莖段需要9～12 d，而葉片需要20 d[14]。當外植體的切口處脫分化形成淺黃色致密的愈傷組織塊，就可進行農桿菌介導的茶樹遺傳轉化，駱穎穎等[15]以茶樹葉片及莖段形成的愈傷組織為受體，采用農桿菌介導法，成功獲得了GUS瞬時表達。但茶樹愈傷組織在遺傳轉化中多運用于瞬時表達驗證，利用愈傷組織實現轉基因植株尚未報道。

在選擇外植體時也要考慮到茶樹品種，茶樹基因型對器官分化及愈傷組織產生起關鍵作用。不同茶樹品種的生理代謝和信號傳遞等基因存在差異，導致茶樹的誘導率和啟動率不同[16]。陳振光等[17]采用福云7號等9個茶樹品種進行花藥培養，發現僅福云7號可誘導出植株。袁弟順等[18]表明在培養條件一致的情況下，不同茶樹品種的愈傷組織生長量不同，由大到小依次為福鼎大白茶、福云595、福安大白、福鼎大毫、福云6號。駱穎穎等[15]對龍井長葉等9個不同茶樹品種的葉片進行遺傳轉化，結果發現僅龍井長葉和浙農23這2個茶樹品種分別在不同的菌系侵染中得到GUS瞬時表達。此外外植體的生長狀態對茶樹遺傳轉化有重要影響，采用幼嫩的外植體較適宜，同時也要考慮外植體的恢復再生水平，張廣輝等[2]表明茶樹發根誘導的最適苗齡為70 d，苗齡因素對葉片發根的影響最大。

1.2 影響茶樹受體系統建立的因素

1.2.1 外植體的消毒。在確保外植體取材適宜后，消毒是茶樹受體系統建立的首要步驟，外植體有效消毒后才能實現后期正常生長及分化。依據茶樹外植體選取的不同，消毒的方式也不同，對茶樹子葉消毒多采用4% 次氯酸鈣、0.1% 氯化汞、吐溫80和75% 乙醇等，及無菌水的多次沖洗[8-9];對茶樹莖段消毒多采用70%乙醇、0.1%氯化汞等，及無菌水的多次沖洗[6，12-13]。外植體消毒后，有效降低了污染率，接種在培養基上，進行后續培養工作。

1.2.2 培養基的選擇。茶樹離體培養中多采用Murashige and Skoog（MS）培養基，MS培養基滿足茶樹離體培養所需要的無機鹽和微量元素。楊國偉等[19]在誘導茶樹愈傷組織時選用無機鹽含量高、微量元素全的MS培養基、無機鹽中等的Heller培養基和無機鹽含量較低的White培養基進行比較試驗，發現MS培養基誘導愈傷組織含量最高，達90%。張婭婷等[20]利用MS 、N6（Chus N-6）和White 為基本培養基，附加相同量的維生素、氨基酸、糖及植物激素等來培育藪北茶芽苗，結果仍是MS培養基的誘導率較優。有研究表明將MS培養基的大量元素減半，利于茶樹莖段的誘導和生長，也可減少莖段褐化，提高成活率[21]。但在茶樹離體培養中培養基的選擇并非限于MS培養基，近年來Lv等[10]在誘導茶樹子葉愈傷組織中，采用改良ER培養基，并于25 ℃左右室溫中光培養25 d，也同樣獲得了優質的愈傷組織。

1.2.3 植物激素及外源添加物的選擇。植物激素在茶樹再生體系中發揮了重大作用，茶樹離體再生的影響因素除了培養基的種類和濃度，還包括植物激素和外源添加物。植物激素是茶樹組織形成、發育及分化等的主要調節物質[22]，不同類型外植體對植物激素需求不同，并且植物激素并非單一發揮作用，而是由多種類激素相互協同、共同調節的條件下促進植物成長發育[23]。茶樹遺傳轉化常見的外植體包括茶樹體胚、莖段及愈傷組織。在茶樹體胚培養中，有研究表明添加苯硼酸（PBOA）和芐基腺嘌呤（BA），或PBOA和激動素（KIN）可高效誘導茶樹體胚增殖[24]，并且使用脫落酸（ABA）也可提高茶樹體胚的誘導率[25]。此外郭玉瓊等[23]發現在培養基中添加0.5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）最有利于茶樹體胚生長。在莖段培養中，培養基中僅添加極低濃度脫葉靈（TDZ）（1 pmol/L～100 nmol/L），能誘導茶樹莖尖增殖和維持較高增殖率[2]，Sandal等[26]利用BA替代TDZ也提高了莖段的分化率，但培養基中BA降解后會導致芽褐化和壞死，可見TDZ在茶樹莖段的離體再生中更具應用潛力。有研究表明高濃度（1～10 μmol/L）的6-芐氨基嘌呤（BAP）結合萘乙酸（NAA）或吲哚丁酸（IBA）也能誘導茶樹莖段分化[22]，此外譚和平等[27]發現細胞分裂素（CTK）與萘乙酸（IAA）共同使用對茶樹莖段的誘導效果較好。推測在茶樹莖段及體胚的離體培養中采用不同植物激素或激素組合，是由不同茶樹品種對植物激素的需求不同而造成的現象。同時在茶樹愈傷組織的培養中，有研究表明不同植物激素對茶樹愈傷組織誘導作用大小不同，表現為2，4-D > BA > NAA[21]。

甜菜堿、肉桂酸、椰乳（CM）、水解酪蛋白（CH）、蔗糖和山梨醇等是茶樹離體再生中常見營養物質[21]。郭玉瓊等[23]研究表明在培養基中添加3 mg/L 肉桂酸有利于茶樹體胚的增殖，且蔗糖或蔗糖與山梨醇的組合也有利于茶樹體胚的增殖。營養物質的添加也可顯著促進芽增殖，尤其是在芽分化初始期[2]，Jha等[28]研究發現在培養基中添加10% CM和1 000 mg/L CH能夠顯著增加莖尖、子葉和分化芽的數量。并且有研究表明在愈傷組織的繼代培養中添加AgNO3對轉化頻率的影響不大，但卻與預培養的培養基存在一定的相互促進作用[29]。在茶樹離體培養中選擇MS為基礎培養基，并添加適量的植物激素、外源添加物等有利于茶樹的離體培養。

1.2.4 外植體褐化及調控。外植體褐化是茶樹離體培養的重點問題，有效控制褐化現象在茶樹受體系統建立甚至整個茶樹遺傳轉化體系中都至關重要。茶樹外植體褐化受內部因素和外部因素的影響。

茶樹基因型不同是造成外植體褐化的主要內部因素，駱穎穎等[15]對安吉白茶等9個不同茶樹品種進行遺傳轉化，發現安吉白茶葉片褐化率達80%，福鼎大白茶達50%。茶樹的生理狀態、生長季節和外植體類型等內部因素對茶樹的離體培養也有影響。茶樹生理狀態不同，接種后褐化程度也不同，處于幼齡期的茶樹外植體褐化較淺，從成年茶樹植株取用的外植體褐化程度較重。茶樹生長季節也很大程度影響外植體褐化，在茶樹莖段培養中春季腋芽褐化率比秋季的低[30]。此外茶樹莖段最易褐化，其次是葉片，子葉褐化率最低[2]。

培養基成分及其濃度、外源添加物和培養條件等外部因素度對外植體褐化程度也有影響。MS培養基中過高濃度的無機鹽會使褐化程度加深，駱穎穎等[15]認為將鹽用量降低至MS培養基半量，可有效降低外植體褐化率。在外源添加物方面，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、維生素C、核黃素和活性炭等是常見的抗氧化劑和吸附劑。有研究表明，在茶樹外植體在接種前，使用2.0 g/L PVP 溶液浸泡30 min抑制褐化的效果最佳。黃燕芬等[31]發現在培養基中添加維生素C和活性炭，褐化率由86% 下降至41%。鄔秀宏等[32]發現培養基中添加維生素C雖有效降低外植體褐化率，但在加熱條件下易分解出酸性物質，使培養基pH下降，而采用核黃素替代，降低褐化率效果更明顯，由57%下降至13.3%;同時，培養時間過長、溫度過高以及光照過強等均會導致多酚氧化酶活性增強，從而加快褐變程度。有研究表明，在相對低溫情況下（8 ℃），外植體褐化率可明顯降低[30]。此外郭玉瓊等[13]發現對茶樹莖基部的切割方式也會影響褐化程度，選擇橫切可有效降低外植體褐化率。

2 茶樹遺傳轉化的方法及影響因素

2.1 茶樹遺傳轉化的方法

常規的植物遺傳轉化方法主要分為農桿菌法介導的外源基因轉化法、種質轉化法和直接基因轉化法3類。種質轉化法包括花粉管通道法、生殖細胞浸泡法等;直接基因轉化法包括脂質體包埋法、聚乙二醇（PEG）介導法、顯微注射法、電激法、離子束法、激光微束法以及基因槍法等[12]。其中花粉管通道法是基因工程和常規育種結合起來的方法，花粉管通道法在茶樹遺傳轉化中有相關研究報道[33]，但轉化后的結實率明顯低于正常植株，技術有待進一步完善。部分DNA直接基因轉移方法，如電擊法、顯微注射和PEG法等以原生質體為轉化受體，要求高的原生質體再生頻率，而茶樹原生質體的再生基礎研究薄弱，研究難度較大[2]。目前茶樹遺傳轉化的方法多采用農桿菌介導法和基因槍法[12]。

2.1.1 農桿菌介導法（Agrobacterium mediated）。農桿菌做為一種天然高效的轉基因載體，在植物遺傳轉化上應用較廣[34]。自然界中存在的農桿菌包括根癌農桿菌（A.tumefaciens）和發根農桿菌（A.rhizogenes）。根癌農桿菌的Ti質粒基因轉化是最常見、應用最廣泛的基因轉化途徑，轉基因植物中80%以上是利用根癌農桿菌轉化的，它具有遺傳穩定、轉化大片段的DNA、操作容易以及成本低等優點[35]。自20世紀90年代以來，運用根癌農桿菌介導法成功獲得多種植物抗性愈傷組織后，人們開始對茶樹的遺傳轉化技術進行探索[8]，利用根癌農桿菌介導茶樹遺傳轉化體系的建立，成為茶樹分子育種的新方向。目前農桿菌介導的茶樹遺傳轉化多采用根癌農桿菌，發根農桿菌的報道較少[2]。

Mondal等[8]首次利用根癌農桿菌（EHA105和LBA4404）來感染茶樹體胚，將雙元質粒p35GUS-INT所攜帶的nptⅡ基因和具有內含子的gus基因導入到茶樹體胚中，篩選出具有Kan抗性和GUS活性的體胚，再經分化培養基培養出嫩梢，最后將轉基因嫩梢嫁接在同種茶樹莖段上，獲得了轉基因茶樹。駱穎穎等[15]總結前人研究得出農桿菌介導的茶樹遺傳轉化的一般條件為：茶樹外植體經3 d 預培養，農桿菌液濃度OD值在0.8左右侵染15 min，25 ℃ 條件下共培養3 d。目前利用根癌農桿菌介導茶樹遺傳轉化，大部分仍限于瞬時表達，穩定表達技術有待提高[12]，遺傳轉化的檢測多采用GUS染色法和PCR檢測技術。

農桿菌介導茶樹遺傳轉化的重點問題是農桿菌轉化效率較低，產生該現象的原因是茶樹中多酚類物質含量較高，農桿菌致病基因Vir基因在轉化時功能消減[6，36]。茶樹中的多酚類物質具有抑菌作用和蛋白質沉淀作用。抑菌作用直接導致農桿菌的生長受到抑制，致使轉化效率降低，而蛋白質沉淀作用使其對農桿菌致病基因Vir基因起拮抗作用，阻塞了農桿菌的T-DNA 向茶樹細胞運轉的通道，從而間接影響農桿菌的轉化效率[6]。通過外部條件的優化可提高農桿菌的轉化效率，Sandal等[11]研究表明采用多酚吸附劑和抗氧化劑雖不能解決農桿菌轉化效率低的問題，但在共培養階段添加適量的L-谷氨酰胺（L-Gln），可減輕多酚類物質的抑菌作用。通過選用抗酚菌株或減少農桿菌與茶樹外植體接觸部位的多酚濃度等，也可提高農桿菌轉化效率。茶樹是一種富含多酚類物質的多年生木本植物，多酚類的抑菌作用使得農桿菌介導的茶樹遺傳轉化困難[37]，建立一套穩定完善的農桿菌介導的茶樹遺傳轉化體系是解決目前轉化效率低的重要途徑[12]。

2.1.2 基因槍法（ bombardmentmediated or biolistic gunmediated）。基因槍法也叫生物彈法，是目前除了農桿菌介導法外應用最廣泛的方法。與農桿菌介導法相比，基因槍法不限于受體植物的范圍，載體質粒構建較為簡單，轉化率也較高[29]。基因槍法的原理是將外源DNA包被在微小金粒或鎢粒表面，利用高壓作用，將微粒高速射入受體細胞或組織內，微粒上外源DNA進入細胞后，整合到植物染色體上得到表達，實現基因轉化。基因槍轟擊效率的高低與受體生理狀態、轟擊條件和轟擊用微彈性狀等因素有關[38]。

20 世紀90 年代，研究人員將基因槍技術首次應用到茶樹遺傳轉化研究上，并比較了基因槍不同發射壓力、入射次數對體胚再生頻率的影響，結果顯示：單槍入射時發射壓力1 100～1 300 psi的再生頻率在20% ～ 30% ;轟擊2次時，1 300 psi會造成過多傷口，不易再生新的體胚[12]。吳姍等[38]對茶樹基因槍轉化體系優化，構建制彈程序為：60 mg/mL鎢粉懸浮液10 μL中加入1.6 μL質粒DNA（1 μg/μL），再分別加入0.1 mol/L的亞精胺4 μL，2.5 mol/L 的CaCl2 15 μL，最后定容至48 μL;每次轟擊上樣量為8～10 μL。此外吳姍等[29]對基因槍介導轉化茶樹愈傷的參數優化，得出：每槍DNA和鎢粉用量分別為0.25、125 μg 可得到較高轉化率;在轟擊壓力7MPa，射程5 cm的條件下，不論對GUS瞬時表達還是愈傷再生都是較為適合的轟擊條件。并且Saini等[9]利用入射壓力7.58 MPa、轟擊距離9 cm的參數將質粒DNA 1.0 μg轟入茶樹體胚，也可成功獲得目標基因的表達。

2.2 影響茶樹遺傳轉化的因素

遺傳轉化過程中一般經預培養、共培養（農桿菌介導法需要）、抗性篩選以及轉基因再生等多個環節。侵染茶樹外植體時農桿菌菌種、菌液濃度和侵染時間及共培養時間、溫度、光照條件和真空度等都會對茶樹遺傳轉化效率產生影響[38]。為了獲得高效穩定的轉化體系，茶樹外植體進行農桿菌浸染、基因槍轟擊的條件需進一步優化。

2.2.1 預培養條件。茶樹遺傳轉化的預培養條件包括預培養時間、基本培養基以及外源添加物。茶樹外植體在進行農桿菌侵染前，進行一段時間的預培養可使外植體處于感受態，有效提高轉化率。有研究表明2～3 d的預培養時間最適宜，此外以MS培養基為基礎培養基，并添加適量的PVP，可顯著提高轉化效率[38]。此外張根義等[39]利用農桿菌轉化煙草中發現，預培養的培養基中含有Ca2+可誘導外植體處于感受態，使轉化效率提高;而吳姍等[38]在農桿菌介導茶樹遺傳轉化中也在預培養的培養基中添加CaCl2，但轉化率明顯降低，推測茶樹是嫌鈣植物，對Ca2+的敏感度比煙草高。

2.2.2 共培養條件。茶樹遺傳轉化的共培養條件包括共培養時間、基本培養基以及外源添加物。共培養是農桿菌介導的茶樹遺傳轉化的關鍵，有研究表明共培養2 d 最有利于提高茶樹的轉化效率[10]。常見共培養的培養基為MS培養基，但存在著誘導頻率低、重復性差等問題。共培養培養基使用YEB培養基效果更佳，張廣輝等[40]以YMB為共培養的培養基，獲得了高的發根誘導頻率，Lv等[10]對比YEB培養基和ER培養基，發現使用YEB培養基轉化率較高。

共培養階段添加適量的外源添加物可促進轉化率的提高。乙酰丁香酮（AS）是共培養中常見的外源添加物，AS可誘導農桿菌中Vir基因以及Ti質粒上repABC 操縱子的表達，促進農桿菌侵染并提高轉化率[41]。Hiei等[42]認為添加AS是促使農桿菌介導水稻轉化的關鍵;茶樹中酚類物質很大程度上限制了農桿菌的轉化率，但添加適量AS也可茶樹的轉化率。項威等[6]研究表明，添加100 μmol/L AS對茶樹愈傷組織轉化最有利。近年來Lv等[10]發現150 μmol/L AS對茶樹愈傷組織的轉化最適宜，而濃度過高的AS，會導致外植體的中毒死亡。有研究表明糖類物質可協助AS等物質誘導高水平的Vir基因表達，提高茶樹的轉化率[43]。此外程振東等[44]研究表明，添加AgNO3可提高農桿菌轉化甘藍型油菜的效率;而趙東等[45]在茶樹中同樣添加AgNO3，發現非但不能促進茶樹轉化率或GUS瞬時表達，反而使其降低，推測Ag+ 對農桿菌具有毒害作用，導致轉化率和GUS瞬時表達降低。

2.2.3 脫菌抗生素的選擇。在農桿菌介導的茶樹遺傳轉化中，使用脫菌抗生素能有效抑制農桿菌活性，防止其危害茶樹組織及細胞[46]。分析不同種類脫菌抗生素對農桿菌的抑菌效果及外植體對抗生素濃度的敏感度是建立農桿菌介導茶樹遺傳轉化體系的關鍵。茶樹遺傳轉化中常見脫菌抗生素有頭孢霉素（Cef）、羧芐青霉素（Car）、潮霉素（Hyg）和特美汀（Tim）等。Mondal等[8]研究表明Cef和Car協同使用，可抑制根癌農桿菌（EHA105和LBA4404）的活性，且對茶樹體胚生長和器官發生的影響不顯著。田麗麗等[47]研究表明Tim 300 mg/L 較Cef 400 mg/L與Hyg 15 mg/L協同使用更有效抑制根癌農桿菌（GV3101），且顯著促進茶樹體胚增殖。研究表明單一抗生素的使用會使農桿菌產生抗藥性，抗生素混合使用能有效減少農桿菌的抗藥性[48]，根據不同農桿菌選擇適合的抗生素并交替使用，可有效降低農桿菌抗藥現象的發生。

2.2.4 篩選試劑的選擇。在選擇培養基中使用篩選試劑會產生一定的選擇壓力，致使未轉化的外植體生長發育不良最終死亡。篩選試劑濃度依據外植體類型不同而存在差異[15]，茶樹遺傳轉化中常見篩選試劑為卡那霉素（Kan）和潮霉素（Hyg），且Hyg的篩選效果優于Kan。趙東等[45]研究表明當葉片愈傷組織切成足夠小薄片，Kan才會起到篩選作用。駱穎穎等[15]也發現茶樹愈傷組織對Kan不敏感，當Kan濃度高達到200 mg/L時，未轉化的愈傷組織仍未完全死亡;而Hyg濃度僅20 mg/L，即可使未轉化的愈傷組織幾乎不生長，并且14 d后未轉化的愈傷組織全部褐化死亡。

3 小結與討論

茶樹遺傳轉化體系面臨的主要問題是離體再生難和轉化效率低[3]。茶樹遺傳轉化的受體多采用體胚、莖段和愈傷組織等，外植體的離體再生率仍有待提高。茶樹體胚和莖段是最具潛力的受體材料，但茶樹莖段誘導率較低，體胚運用仍較廣泛，如Mondal等[8]、Jeyaramraja等[49]和Singh等[50]均利用茶樹體胚成功獲得了轉基因茶樹，但存在的問題是體胚遺傳背景與母體之間有較大差異且誘導周期長。茶樹愈傷組織的遺傳轉化多應用于GUS瞬時表達驗證，從愈傷組織實現植株再生是茶樹等木本植物需突破的重要技術瓶頸。原位轉化技術是直接將茶樹活體與農桿菌接觸，減緩了酚類物質的抑菌作用，其根本特點在于不需組織或細胞培養手段，而達到植物在活體狀態下的轉化[51]。目前原位轉化技術在植物遺傳轉化技術中研究較廣泛，擬南芥[52]、苜蓿[53]、白菜[54]和蘿卜[55]等植物上均有相關研究進展，而茶樹采用農桿菌介導的遺傳轉化效率低的原因是由于茶樹組織中的酚類物質具有殺菌作用，從而抑制農桿菌侵染率，茶樹遺傳轉化中采用原位轉化技術的研究較少，Alagarsamy等[56]利用發根農桿菌對60 d齡的茶樹品種“農抗早”的下胚軸進行侵染，并保持在高濕環境中進行培養，60 d后88.3%侵染部位發育成毛狀根。因此將農桿菌介導的原位轉化技術應用到茶樹轉基因中具有前景。

茶樹對農桿菌不敏感，轉化效率偏低是農桿菌介導的遺傳轉化的主要難題[29]，基因槍介導的遺傳轉化的轉化率較農桿菌介導的高，但此項技術仍需完善，如儀器可控性、準確性、精確性和轟擊后進入受體細胞DNA的生物學變化及其調控機理等[6]。吳姍等[29]發現利用農桿菌侵染和基因槍轟擊相結合的技術，比起兩種方法單獨使用，更有助于提高茶樹的轉化率，農桿菌侵染與基因槍轟擊相結合能有效提高轉化率，可將這兩項技術充分發揮在茶樹遺傳轉化的研究中。此外花粉管通道法在茶樹遺傳轉化也有待完善，應避免人工處理時對花器造成的機械傷害，提高轉化后的結實率[33]。此外可借鑒在其他植物中應用的生殖細胞浸泡法、PEG介導法、顯微注射技術、電激法、離子束法和激光微束法等遺傳轉化技術，填補茶樹遺傳轉化技術空白。

茶樹次生代謝產物種類繁多且在生化分析上取得較多成果[57-58]，但重要次生代謝產物的代謝途徑及基因調控方面的研究較少，可通過茶樹遺傳轉化技術，完善建立轉基因體系，研究茶樹次生代謝的基因調控[12]。此外，利用茶樹遺傳轉化技術也可進行茶樹抗逆能力改良，將抗病蟲、抗寒、抗旱等基因導入茶樹中來提高茶樹抗性，如利用遺傳轉化技術將抗病蟲基因（Bt基因）導入茶樹中，提高茶樹抗病蟲能力，獲得抗病蟲轉基因新品種，有效降低茶葉的農殘問題[59]，從根源上提高茶樹抗性，培育出具有高產、優質和適宜當地環境的新品種，使茶樹品種選育滿足生產和市場的需求。

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