結核分枝桿菌耐藥基因分布情況的初步探討

鞠福娟

【摘 要】 目的：針對醫院結核分枝桿菌耐藥基因的分布情況進行分析研究。方法：收集900株ropB、KatG和inhA的MTB耐藥基因分布情況。結果：MTB感染的900例患者中共檢出151株ropB基因突變型，突變率16.78%，合計耐異煙肼基因突變率為19.89%（179/900），其中KatG AGC→ACC突變型占81.56%（146/179）。結論：對MTB利福平和異煙肼耐藥的因素主要是ropB基因511、516、526及531位點突變和KatG AGG→ACC突變，在MTB耐藥基因中可采用基因芯片技術作為快速篩選方法。

【關鍵詞】 結核分枝桿菌;耐藥基因;基因分布

【中圖分類號】R766.1

【文獻標志碼】A

【文章編號】 1005-0019（2019）14-016-02

1 前言

世衛組織結核病報告有關數據顯示，我國結核病患者位居世界第三，屬于30個高負擔的結核病國家。根據世衛組織估算，每年我國結核病新發患者高達90萬例，其中有7萬例新發患者屬于耐多藥結核病。對結核病防控的重要影響因素就是耐藥結核分枝桿菌（MTB）傳播，治療耐多藥結核患者費用相當于藥物敏感患者費用的二十余倍。快速檢測具有MTB及其耐藥性的可精準治療患者，能夠進一步縮短患者病程，使患者疾病痛苦得到有效緩解，耐藥菌株傳播范圍明顯降低。為實現對各種MTB耐藥基因分布規律進行分析比較，制定有效并適應于MTB耐藥菌株的一種快速篩選方法，本研究采用基因芯片技術對檢測MTB耐藥基因的有關數據進行了較深入地分析。

2 資料與方法

2.1 菌株資料

收集2015年6月—2016年6月分離的900株MTB。采用核酸快速提取儀、基因微陣列芯片雜交盒、微陣列芯片掃描儀等設備及MTB耐藥基因檢測試劑開展相關研究工作。

2.2 方法

在核酸提取方面，從液體培養基中吸取與1個麥氏單位濁度相當的15微升菌懸液加入核酸提取管中，添加核酸提取液試劑80微升，采用核酸快速提取儀振蕩5分鐘，在95攝氏度溫度下進行5分鐘金屬浴，以5000轉/分鐘速度進行離心1分鐘，得到的核酸提取液暫存在零下20攝氏度。在核酸擴增方面，PCR擴增試劑平衡到室溫，向離心瞬時到管底，主要采用每管18微升分裝，分別將2微升DNA加入模板。在芯片雜交方面，雜交反應物配制比例是雜交緩沖液9微升與擴增產物3微升，加熱到95攝氏度變性5分鐘，然后及時進行5分鐘冰水浴。將混合液13.5微升向雜交芯片加樣孔中加入，置入芯片雜交盒中50攝氏度雜交2小時。在洗滌、干燥及掃描方面，枸櫞酸水按照2倍標準依次與0.2%十二烷基硫酸鈉進行3分鐘振蕩洗滌，按照800轉/分鐘離心5分鐘，甩干后掃描，對結果進行判讀。在控制質量方面，每次擴增時都采用陽性和陰性對照，陽性對照用于控制PCR擴增與雜交過程質量，陰性對照用于對環境及操作中的污染進行監測。將空白對照、陽性陰性內對照、雜交陽性外對照探針、表面化學質控探針及野生型探針都設置到每張芯片上，以實現對菌株雜交過程的有效監控。

2.3 統計分析

對患者有關數據采用SPSS 17.0數據處理軟件進行分析，對患者計數資料的表示采用百分率形式，利用描述性統計分析方法進行研究。

3 結果

MTB感染的900例患者中共檢出151株ropB基因突變型，突變率16.78%。ropB基因位點突變率按照由大到小為531[占50.99%（77/151）]、516[占20.53%（31/151）]、526[占15.23%（23/151）]、511[占10.59%（16/151）]、513[占1.99%（3/151）]、533[占0.67%（1/151）]。檢出155株KatG突變株，突變率為17.22%（155/900），33株inhA突變型，突變率為3.67%（33/900），合計耐異煙肼基因突變率為20.89%（189/900）。其中KatG AGC→ACC突變型占81.56%（146/179）。

4 討論

近年來，基因芯片技術屬于一種MTB耐藥基因檢測新技術，是近年來逐漸得到業界關注的新技術之一，根據有關驗證結果顯示，應用此方法對利福平的耐藥靈敏度和特異度檢測結果分別可達到87.24%和97.36%，對異煙肼的耐藥靈敏度和特異度檢測結果分別可達到為80.22%和95.49%。對利福平耐藥基因采用基因芯片法檢測與表型檢測可超過95%的相符率。在RRDR 81bp密碼子上有大部分rpoB基因突變集中的表現。本研究中突變率最高的是531位點，占50.33%，與青島的52.5%比較接近，比深圳的76.1%低。異煙肼耐藥產生有關突變的比率存在比較明顯的地區差異性，本研究中在異煙肼耐藥中inhA突變率為3.67%，KatG突變率為17.22%，二者合計突變率為20.89%。其中KatG AGC→ACC突變型占81.56%。存在差異性的原因主要是：一是芯片對突變位點或基因型未達到完全覆蓋。二是芯片檢測到的突變型未能導致耐藥突變;三是耐藥性采用的傳統藥敏試驗檢測方法主要根據臨界水平判斷，與傳統藥敏試驗臨界水平相比，基因芯片法可檢測到相對更低的低度耐藥突變菌株。

5 結語

綜上所述，導致醫院中患者對MTB利福平和異煙肼耐藥的因素主要是ropB基因511、516、526及531位點突變和KatGG→C突變，在MTB耐藥基因中可采用基因芯片技術作為快速篩選方法。

參考文獻

[1] 李同霞，江國峰，郝文嘉等.結核分枝桿菌臨床分離株利福平和異煙肼耐藥性檢測方法比較[J]，中國現代醫學雜志，2017.8

[2] 王峰，桂靜，趙廣錄等.基因芯片檢測結核分枝桿菌利福平異煙肼耐藥性的應用評價[J]，中華檢驗醫學雜志，2018.3

[3] 潘建華，羅丹，石國民等.2012-2015年長沙地區肺結核患者結核分枝桿菌耐藥狀況分析[J]，現代預防醫學，2017.11

[4] 歐維正，駱科文，陳崢宏等.貴州地區結核分枝桿菌利福平耐藥相關基因rpoB突變特征分析[J]，中國臨床藥理學雜志，2017.9