吸入法建立急性一氧化碳中毒遲發型腦病大鼠模型

陳超　王寶軍　項文平　李月春　郝喜娃　龐江霞　高浩然　?謝偉

[摘要] 目的 建立符合臨床特點的大鼠急性一氧化碳中毒遲發型腦病（DEACMP）模型。 方法 采用隨機數字表法將認知功能篩查合格的雄性Wistar大鼠196只分為實驗組和對照組，實驗組164只，對照組32只。對照組吸入空氣，實驗組吸入一氧化碳（CO）氣體，根據吸入CO濃度不同分為三組，分別為1000、3000、4000 ppm組，每組存活32只，連續吸入CO 40 min保持中毒濃度穩定;各組大鼠分別在中毒后7、14、21和28 d處死大鼠取材;采用分光光度計分析碳氧血紅蛋白（COHb）水平;采用水迷宮訓練評估各組大鼠中毒后認知功能的變化情況，采用HE染色方法觀察大鼠海馬細胞受損情況，明確建立可靠的大鼠DEACMP模型的方法。 結果 吸入CO后大鼠出現明顯中毒表現，COHb水平與吸入CO濃度大小呈正相關（r = 0.748，P < 0.05），1000、3000、4000 ppm組及對照組大鼠死亡率分別為0%、40.74%、58.97%、0%，各組大鼠DEACMP發生率分別為6.25%、28.13%、31.25%、0%，在中毒后21、28 d大鼠DEACMP高發，選擇死亡率低、發病率高、并結合大鼠飼養周期，明確大鼠吸入CO濃度3000 ppm，中毒后21 d可以建立DEACMP大鼠模型。 結論 大鼠吸入CO濃度3000 ppm 40 min，21 d后可以建立可靠DEACMP模型，為DEACMP的預防和治療帶來新的希望。

[關鍵詞] 一氧化碳中毒;動物模型;遲發型腦病

[中圖分類號] R74 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）05（c）-0004-04

[Abstract] Objective To establish a model of delayed encephalopathy acute carbon monoxide poisoning （DEACMP）. Methods A total of 196 intelligence-qualified rats were divided into experimental group and control group by random number table method， with 164 rats in the experimental group and 32 rats in the control group. The experimental group used an acute static inhalation of carbon monoxide （CO） to establish a poisoned rat model. According to different concentrations of CO poisoning， they were randomly divided into 1000， 3000， 4000 ppm group， with 32 rats alive in each group. Each group continued to inhale for 40 minutes. Rats in each group were sacrificed at 7， 14， 21 and 28 d after poisoning. Spectrophotometer method was used to dynamically monitor the changes of carboxyhemoglobin （COHb） content in each group. Morris water maze test was used to evaluate cognitive function. HE staining was used to observe the cell damage in hippocampus. The best poisoning concentration and time for establishing a DEACMP rat model was established. Results After poisoned by CO， the rats showed typical symptoms of poisoning. There was a significant positive correlation between COHb content and CO concentration （r = 0.748， P < 0.05）. The mortality rates of the 1000， 3000， 4000 ppm group and the control group were 0%， 40.74%， 58.97% and 0%， respectively. The incidence of DEACMP in each group was 0%， 6.25%， 28.13%， 31.25%， and 0%， and the 21 d and 28 d after being poisoned were high DEACMP time points. Based on the low mortality rate and high incidence rate， the CO poisoning concentration of 3000 ppm and the time of 21d were the best method to establish a DEACMP rat model. Conclusion A DEACMP rat model can be established with a static inhalation concentration of 3000 ppm CO for 40 minutes， and models can be successfully established 21 days after poisoning.

[Key words] Carbon monoxide poisoning; Animal model; Delayed encephalopathy

CO中毒是常見的窒息性中毒之一，廣泛存在于人們生產生活環境中，當空氣中CO濃度超過35 ppm即可出現中毒癥狀[1-3]，中毒可引起多個臟器功能損害[4]，一氧化碳中毒遲發型腦病（delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP）是其中較常見的并發癥[5]，發病率為0.2%～47.3%[6]，其臨床表現較重，以認知障礙為主，致殘率較高，給患者生活帶來嚴重影響[7]。目前對于DEACMP的發病機制及治療雖然已有大量研究，但仍不能合理闡明，成功建立動物模型是進一步研究DEACMP的基礎，將有助于闡明其發生過程，為臨床預防與治療提供可靠的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性的Wistar大鼠共208只，購自內蒙古大學動物研究培育中心，大鼠體重180～230 g，飼養于室溫18～23℃且12 h明暗交替的室內，自由進食水。

1.2 主要儀器與試劑

動物CO中毒箱，自行設計，用鋼化玻璃制成的體積為0.7 m×0.5 m×0.43 m的長方體，使用膠粘劑封閉中毒箱連接處，箱體分別設置進氣口、出氣口及CO濃度檢測儀連接處;CO氣體濃度檢測儀，購自金盾安全防護有限公司及元特科技有限公司;Morris水迷宮及圖像自動監視系統;Leica CM1950冰凍切片機;T6新悅-可見分光光度計;CO標準氣體，購自佛山市科的氣體有限公司。

1.3 動物訓練

首先將大鼠放置在水迷宮平臺上數秒熟悉環境，隨后依次在4個象限進行訓練，電腦自動記錄大鼠運動軌跡和找到平臺時間。訓練5 d后選擇逃避潛伏期<60 s，運動軌跡為直線式或趨向式的大鼠為合格，不合格者淘汰。

1.4 模型建立及分組情況

隨機將196只訓練合格的大鼠分為實驗組及對照組，實驗組164只，對照組32只，實驗組給予急性靜態吸入CO氣體建立中毒模型[8-9]，依據CO中毒濃度不同分為三組，即1000、3000及4000 ppm組，連續吸入CO 40 min保持中毒濃度穩定;對照組通入等量的空氣，其他條件不變。因CO濃度不同大鼠死亡情況不同，為保證后期實驗正常進行，中毒后每組各需要存活大鼠32只，隨后將其分別隨機分為四個時間點，即中毒后7、14、21和28 d處死大鼠取材，共計16組，每組各8只。

1.5 碳氧血紅蛋白（carboxyhemoglobin，COHb）含量檢測

分別在中毒后15、30、60、120和240 min，斷尾取大鼠血，采用改良雙波長定量法檢測COHb含量，按照公式計算：COHb（%）=（2.44×A535/A578-2.68）×100%。

1.6 DEACMP模型建立成功的標準

各組大鼠分別于中毒后4個時間點行水迷宮定位航行實驗，記錄大鼠運動軌跡和逃避潛伏期，大鼠常規多聚甲醛心臟灌注固定后取腦行病理學觀察。參考Ochi等[10]研究結果判斷DEACMP模型是否成功：水迷宮結果提示大鼠認知功能發生障礙，并且HE染色發現大鼠腦內海馬組織細胞受損。

1.7 統計學方法

采用SPSS 20.0對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson法進行單因素相關性分析，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠CO中毒后表現

向中毒箱通入CO氣體5～10 min后大鼠開始出現多動、表現活躍，15～20 min后出現癱軟無力、活動減少、不能站起、呼吸淺快，口周、耳部、肢端皮膚呈櫻桃紅色，3000 ppm及4000 ppm組大鼠中毒癥狀較重，部分發生抽搐、角弓反張、昏迷甚至死亡。解剖死亡大鼠發現多臟器充血伴局部點片狀出血;腦組織高度充血，周圍間質水腫，部分出現點狀出血，與報道急性CO中毒表現相符。

2.2 中毒后大鼠COHb含量變化

中毒箱中通入CO 15 min后測得各組大鼠COHb含量均升高，1000 ppm組COHb含量16.32%～22.92%，3000 ppm及4000 ppm組32.13%～75.65%，符合中、重度中毒標準，中毒后15 min測得COHb含量與吸入CO濃度大小呈正相關（r = 0.748，P < 0.05），見圖1，COHb含量隨時間變化情況見圖2。

2.3 各組大鼠死亡情況比較

對照組及1000 ppm組大鼠在中毒過程中無死亡情況發生;3000 ppm組、4000 ppm組大鼠死亡多發生在中毒30～40 min。3000、4000 ppm組大鼠死亡率分別為為40.74%（22/54）、58.97%（46/78），對照組、1000 ppm組大鼠死亡率均為0%，實驗組各組間死亡率比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。

2.4 DEACMP發生情況

2.4.1 水迷宮結果 ?實驗結果顯示，1000 ppm組大鼠各時間點逃避潛伏期與對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）;3000 ppm及4000 ppm組大鼠在中毒后21、28 d與對照組、1000 ppm組比較逃避潛伏期明顯增加，差異有統計學意義（P < 0.05）;與中毒前比較，3000 ppm及4000 ppm組大鼠在中毒后21、28 d逃避潛伏期明顯增加，差異有統計學意義（P < 0.05）（表1、圖3）。

2.4.2 病理學結果 ?對照組大鼠海馬組織細胞形態正常、細胞核、細胞膜結構完整清晰，3000 ppm組及4000 ppm組大鼠部分可見海馬組織細胞排列稀疏、細胞萎縮、數量減少、大小不等、結構模糊不清，未發現明顯壞死灶，見圖4。

結合以上水迷宮與病理結果，判斷各組大鼠DEACMP發生情況，對照組、1000 ppm組、3000 ppm組及4000 ppm組DEACMP的發生率分別為0（0/32）、6.25%（2/32）、28.13%（9/32）、31.25%（10/32）;3000 ppm組與4000 ppm組DEACMP發生率比1000 ppm組明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）;3000 ppm組與4000 ppm組之間DEACMP發病率比較，差異無統計學意義（P > 0.05）;1000 ppm組大鼠在中毒后28 d有2只發生DEACMP，3000 ppm組在14 d有1只發病，在21、28 d均有4只發病，4000 ppm組在7、14 d分別有1只發病，在21、28 d分別有5只和3只發病，DEACMP在3000 ppm組與4000 ppm組中毒后21、28 d高發，差異有統計學意義（P < 0.05），相同濃度在21、28 d之間比較，差異無統計學意義（P > 0.05），結合大鼠飼養周期，選擇死亡率低、發病率高的組別，明確大鼠吸入CO濃度3000 ppm、時間21 d可以建立可靠的DEACMP動物模型。

3 討論

DEACMP患者常出現神經精神異常（智能、人格、行為等改變），病程較長，治療困難，常遺留精神或認知障礙[11-12]，這是目前臨床工作中亟待解決的難題，深入研究DEACMP的基礎是建立可靠的動物模型，本課題在Hara等[8-9]研究基礎上進行了驗證和改進，使實驗更加安全、結果更加可靠。與腹腔注射CO比較[13]，吸入法與日常中毒情況更接近，代表性更好;中毒時氣體通過密封性良好的管道進入中毒箱，實驗人員不易發生意外中毒，安全性較高;但吸入法存在隨著中毒時間延長，中毒箱內氧氣減少、二氧化碳潴留等情況，為了改善這些情況對實驗結果的影響，本研究采用每次減少中毒大鼠只數，來增加實驗的可靠性。

COHb含量高低是判斷CO中毒嚴重程度的重要方法之一，相關研究[14-15]發現是否發生DEACMP與中毒的嚴重程度呈正相關。本研究發現DEACMP在3000 ppm組及4000 ppm組中發生率較高，且兩組COHb含量可達中、重度中毒標準，說明中毒程度直接影響DEACMP的發生，該研究結果與相關研究[14-15]結果相符;中毒后15 min COHb含量與吸入CO濃度呈正相關，與Li等[15]研究結果一致，提示本研究建立的DEACMP模型可靠。

Morris水迷宮實驗是反映認知功能變化較好的實驗方法之一，其結果準確可信，是判斷動物認知功能的重要方法[16-17]。實驗前期首先通過水迷宮訓練篩選出智力、運動功能正常的大鼠，淘汰了學習記憶不合格大鼠，避免了動物之間個體差異對實驗結果的影響，使得實驗結果更加可靠和準確。本研究水迷宮結果顯示，3000 ppm組及4000 ppm組大鼠逃避潛伏期在中毒后21、28 d較對照組明顯延長，差異有統計學意義（P < 0.05），說明在中毒后21、28 d兩組大鼠認知功能發生改變。相關研究[18-20]發現CO中毒后腦內海馬組織細胞廣泛損害，病理學表現細胞結構不清、層數變薄、體積縮小等，本實驗HE染色發現DEACMP大鼠海馬組織細胞排列稀疏、細胞萎縮、數量減少、大小不等、結構模糊不清，說明中毒后大鼠海馬組織細胞存在損傷。根據病理學及水迷宮結果共同判定大鼠吸入CO濃度3000 ppm、時間21 d可以建立可靠的DEACMP模型，為DEACMP發病機制的研究提供了可靠基礎，為DEACMP的預防與治療帶來新的希望。

[參考文獻]

[1] ?Rose JJ，Wang L，Xu Q，et al. Carbon monoxide poisoning：pathogenesis，management，and future directions of therapy [J]. Am J Respir Crit Care Med，2017，195（5）：596-606.

[2] ?Borger J. The danger of carbon monoxide poisoning associated with hookah use：an emergency physician′s perspective [J]. N C Med J，2017，78（6）：424.

[3] ?McKenzie LB，Roberts KJ，Shields WC，et al. Distribution and Evaluation of a Carbon Monoxide Detector Intervention in Two Settings：Emergency Department and Urban Community [J]. J Environ Health，2017，79（9）：24-30.

[4] ?Wang B，Xiang W，Xue H，et al. Efficacy of N-Butylphthalide and hyperbaric oxygen therapy on cognitive dysfunction in patients with delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning [J]. Med Sci Monit，2017， 23：1501-1506.

[5] ?Jorge A. Carbon monoxide poisoning [J]. Crit Care Clin，2012， 28：537-548.

[6] ?Goldstein M. Carbon monoxide poisoning [J]. J Emerg Nurs，2008，34：538-542.

[7] ?Xiang W，Xue H，Wang B，et al. Combined application of dexame-thasone and hyperbaric oxygen therapy yields better efficacy for patients with delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning [J]. Drug Des Devel Ther，2017，11：513-519.

[8] ?Hara S，Mizukami H，Kurosaki K，et al. Existence of a threshold for hydroxyl radical generation independent of hypoxia in rat striatum during carbon monoxide poisoning [J]. Arch Toxicol，2011，85：1091-1099.

[9] ?Hara S，Mizukami H，Kuriiwa F，et al. cAMP production mediated through P2Y（11）-like receptors in rat striatum due to severe，but not moderate，carbon monoxide poisoning [J]. Toxicology，2011，288：49-55.

[10] ?Ochi S，Abe M，Li C，et al. The nicotinic cholinergic system is affected in rats with delayed carbon monoxide encephalopathy [J]. Neurosci Lett，2014，569：33-37.

[11] ?Sun X，Xu H，Meng X，et al. Potential use of hyperoxygenated solution as a treatment strategy for carbon monoxide poisoning [J]. PLoS One，2013，8（12）：e81779.

[12] ?Guan L，Zhang YL，Li ZY，et al. Salvianolic acids attenuate rat hippocampal injury after acute CO poisoning by improving blood flow properties [J]. Biomed Res Int，2015，2015：526483.

[13] ?Xiang WP，Xue H，Wang BJ，et al. Delayed encephalopathy of acute carbon monoxide intoxication in rats：potential mechanism and intervention of dexamethasone [J]. Pak J Pharm Sci，2014，27：2025-2028.

[14] ?Chen Q，Bai J，Li CR，et al. Changes of HbCO in the blood of rats with different CO concentration and inhalation time [J]. Fa Yi Xue Za Zhi，2016，32（6）：410-412.

[15] ?Li Q，Bi MJ，Bi WK，et al. Edaravone attenuates brain damage in rats after acute CO poisoning through inhibiting apoptosis and oxidative stress [J]. Environ Toxicol，2016，31（3）：372-379.

[16] ?Roderique JD，Josef CS，Newcomb AH，et al. Preclinical evaluation of injectable reduced hydroxocobalamin as an antidote to acute carbon monoxide poisoning [J]. J Trauma Acute Care Surg，2015，79：116-120.

[17] ?Zhang J，Wu H，Zhao Y，et al. Therapeutic effects of hydrogen sulfide in treating delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning [J]. Am J Ther，2016， 23（6）：e1709-e1714.

[18] ?Li HM，Shi YL，Wen D，et al. A novel effective chemical hemin for the treatment of acute carbon monoxide poisoning in mice [J]. Exp Ther Med，2017，14（5）：5186-5192.

[19] ?Xue L，Wang WL，Li Y，et al. Effects of hyperbaric oxygen on hippocampal neuronal apoptosis in rats with acute carbon monoxide poisoning [J]. Undersea Hyperb Med，2017，44（2）：121-131.

[20] ?Watanabe S，Matsuo H，Kobayashi Y，et al. Transient degradation of myelin basic protein in the rat hippocampus following acute carbon monoxide poisoning [J]. Neurosci Res，2010，68（3）：232-240.

（收稿日期：2018-01-24 ?本文編輯：金 ? 虹）