基于Schiff堿結構的香豆素類熒光探針的合成及對Mg2+的識別

楊文生， 楊 菀， 馬亞軍

(榆林學院 化學與化工學院， 陜西 榆林 719000)

1 引 言

鎂元素是生命過程中必不可少的生物離子[1-2]，在生命體中以二價離子的形式存在，廣泛分布在人體的各種細胞及身體器官中。鎂離子參與了人體的多種生理活動[3]，比如細胞的增殖、生物酶反應、構建轉運蛋白、信號傳導及DNA結構的穩定[4]等。鎂離子在細胞功能中起著關鍵作用，它的缺失將會導致細胞的死亡。成年人每日攝入鎂的量應達到300 mg，其來源主要為海鮮、蔬菜、奶制品及全谷類[5]。鎂離子攝入量過多或缺乏均會導致各種疾病[6-7]。當鎂離子在人體內含量超標時，會導致代謝紊亂并對骨骼、胃腸道、神經元及腎臟造成危害[8]。而鎂離子在人體內長期以低濃度存在時，往往導致糖尿病、心臟病、低鈣血癥、骨質疏松癥等疾病[9-10]。此外，鎂離子還是植物體內葉綠素的重要組成部分，參與了植物所需的光合作用，因而對于維持生物的正常生長具有非常重要的作用。因此，我們很有必要尋找一種快速有效地檢測生物系統和環境中的鎂離子的方法。

檢測鎂離子常用的手段主要有EDTA滴定法、同位素質譜法、原子吸收分光光度法、離子層析法及鎂試劑比色法等[11]。與這些傳統的檢測方法相比較，熒光探針法具有選擇性和靈敏度高、可實時檢測、操作簡單、測試速度快及成本比較低等優勢，因而引起了研究人員的廣泛關注[12-13]。近年來，鎂離子熒光探針已有大量報道，然而大多數報道的鎂離子熒光探針難以區分鎂離子和鈣離子，主要是由于鎂離子與鈣離子化學性質很相似，造成不能高選擇性地識別鎂離子。

本文所合成的新型熒光探針具有能夠高選擇性識別鎂離子而不受鈣離子影響的特點，采用常規手段核磁譜及質譜表征了產物的結構和組成，通過一系列分析測試方法研究了該探針的光譜性質及反應機理。

2 實 驗

2.1 儀器與試劑

Hitachi F-7000熒光光譜儀，日本日立公司；Bruker 400 MHz核磁共振儀，瑞士布魯克公司；Bruker Esquire 6000 質譜儀，德國布魯克公司；XT4-100X顯微熔點測定儀，北京電光儀器廠。

7-羥基香豆素、2-氨基苯并咪唑、冰乙酸、六次甲基四胺、無水甲醇(AR，國藥基團化學試劑有限公司)；NaNO3、KNO3、LiNO3、AgNO3、Pb(NO3)2、Al(NO3)3、Ba(NO3)2、Hg(NO3)2·H2O、Cd(NO3)2·4H2O、Co(NO3)2·6H2O、MnCl2·4H2O、Cu(NO3)2·3H2O、Ni(NO3)2·6H2O、Zn(NO3)2·6H2O、Fe(NO3)3·9H2O、Mg(NO3)2·6H2O、Cr(NO3)3·9H2O、Ca(NO3)2·4H2O(AR，上海阿拉丁試劑有限公司)。

實驗中所用其他試劑均為AR。實驗所用蒸餾水為二次蒸餾制得。金屬離子儲備液均由金屬硝酸鹽和水合金屬硝酸鹽制備得到。

2.2 探針的合成

圖1為探針L的合成路線。

圖1 探針L的合成路線

2.2.1 中間體I的合成

準備好250 mL的單口圓底燒瓶，加入5 g 7-羥基香豆素和50 mL冰乙酸，隨后加入10 g六次甲基四胺，放入磁子并攪拌均勻，設置加熱溫度為95 ℃，開始加熱回流約6 h，將反應物稍微冷卻后加入75 mL的20%鹽酸，重新調節溫度為60 ℃，在該溫度下加熱回流30 min。將反應產物自然冷卻后用乙醚進行萃取，將萃取后的澄清有機溶液合并到錐形瓶中，加入適量的無水Na2SO4，用玻璃棒充分攪拌進行干燥，然后過濾，將濾液濃縮后得到黃色的固體產物，再進行重結晶操作，真空干燥后得到1.56 g淡黃色固體，即為中間體I，產率27%，熔點188.3～189.4 ℃。

2.2.2 探針L的合成

在干凈的250 mL的單口圓底燒瓶中，加入0.27 g 2-氨基苯并咪唑與35 mL無水甲醇，在80 ℃加熱回流，充分攪拌使其溶解。取干凈的小燒杯，加入0.38 g 中間體I與50 mL無水甲醇，用玻璃棒攪拌使其溶解完全。然后用滴管逐滴將小燒杯中的溶液移入圓底燒瓶中。加熱回流不久，析出大量沉淀。繼續回流24 h，將反應物自然冷卻后減壓濃縮至最初的20%，然后過濾，用冷的無水甲醇淋洗兩次，真空干燥后得到0.27 g棕紅色固體粉末，即為探針L，產率44%，熔點291.3～292.5 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ13.02(s, 1H), 10.39(s, 1H), 9.93(s, 8H), 8.05～7.91(m, 9H), 7.80(d,J=8.7 Hz, 9H), 7.57(s, 11H), 7.27～ 7.10(m, 19H), 7.02～6.88(m, 10H), 6.55(s, 1H), 6.37(d,J=9.5 Hz, 8H), 3.46 (d,J=7.0 Hz, 1H)。13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ164.74,160.02,155.50,152.92,145.03,134.92,122.96,120.15,114.53,112.83,111.92,111.48,106.88。ESI-MS：m/z306.5[M+H]+。

2.3 光譜測試

稱取適量探針移入容量瓶中，用溶劑DMF溶解并定容，配制成濃度為1.0×10-3mol/L的探針儲備液待用。稱取適量金屬硝酸鹽或水合金屬硝酸鹽移入容量瓶中用蒸餾水定容，配制濃度為1.0×10-3mol/L金屬離子儲備液待用。在熒光發射光譜測試中，向石英比色皿中加入2 mL的MeOH∶H2O=1∶1(V∶V) 的混合溶液(pH=7.2)，接著用微量進樣器加入20 μL的待用的探針儲備液(測定檢測限加入5 μL待用的探針儲備液)，最后加入待用的金屬離子儲備液，進行光譜測試。其中熒光發射光譜的激發波長為395 nm，狹縫均為10 nm。

3 結果與討論

3.1 探針對金屬離子的識別性能

研究了探針對常見金屬離子的識別能力，結果如圖2所示。發現大多數金屬離子加入后的熒光強度比較低，表明對探針沒有響應或只有微弱的響應。而當加入Mg2+時，在498 nm處出現一個很強的熒光發射峰，測試溶液在365 nm紫外光下發出明亮的藍綠色熒光，結果顯示在圖2中。表明Mg2+對探針有積極的響應，即探針對Mg2+有很好的選擇性。其原因主要是在加入Mg2+之前，探針分子中的N原子上的孤對電子向香豆素基團轉移電子，此時探針分子的熒光非常微弱；當加入Mg2+之后，N原子上的孤對電子與Mg2+形成配位鍵，限制了孤對電子轉移，使得光誘導電子轉移受阻，從而造成探針出現很強的熒光發射。

圖2 不同金屬離子存在下探針(1.0×10-5mol/L)的熒光發射光譜

Fig.2 Fluorescence emission spectra of probe(1.0×10-5mol/L)in the presence of different metal ions

3.2 探針對Mg2+的熒光發射光譜

在MeOH∶H2O=1∶1(V∶V)的混合溶液中，加入濃度為1.0×10-5mol/L探針溶液，然后逐漸滴加Mg2+溶液，觀察熒光發射光譜的熒光強度不再增加為止。如圖3所示，可以發現隨著Mg2+濃度的增加熒光發射光譜逐漸增強，其熒光發射峰出現在498 nm 處。從起始到滴定終點的熒光強度增加了約7倍，變化十分顯著。在圖3的右上

圖3 探針(1.0×10-5mol/L)隨著Mg2+濃度增加的熒光發射光譜

Fig.3 Fluorescence emission spectra of probe(1.0×10-5mol/L)with the increase of concentration of Mg2+

角小插圖是滴定曲線圖，可見隨著Mg2+濃度的增加，曲線緩慢增加，當Mg2+的加入量為1.0當量時，熒光強度達到最大值。所以可以判斷探針與Mg2+是按1∶1進行配位的。

3.3 共存金屬離子的影響

設F0為探針本身的熒光強度，F為不同金屬離子加入時的熒光強度。如圖4所示，可知在所有共存金屬離子中，Mg2+比其他金屬離子具有更強的競爭能力，通常對Mg2+形成嚴重干擾的Ca2+在這里并沒有對Mg2+構成影響。雖然Cd2+對熒光有一定的猝滅，但并不影響競爭結果。因此，探針在選擇性識別Mg2+的同時，并不受到其他共存離子的影響，具有很好的抗干擾能力。

3.4 可逆性實驗

可逆性是具有實用價值的熒光探針應具備的性質。圖5(a)表示濃度為1.0×10-5mol/L的探針溶液的熒光強度；圖5(b)表示向濃度為1.0×10-5mol/L的探針溶液中加入1.0當量的Mg2+溶液后的熒光強度；圖5(c)表示再向上述溶液中加入1.0當量的EDTA后的熒光強度。可見最初探針的熒光很微弱，當加入Mg2+后，探針與Mg2+

圖5 探針識別Mg2+ 的可逆性實驗

相互配位，從而發出強烈的藍綠色熒光。接著再加入EDTA后溶液的強熒光重新恢復到微弱的狀態，這是由于具有更強配位能力的EDTA與Mg2+結合形成新的配合物，并釋放出探針，其變化過程見圖5的右上角示意圖。因此探針識別Mg2+的過程是可逆的。

3.5 探針與Mg2+的配位比的確定

采用熒光光譜法確定探針與Mg2+的配位比。具體在Job’s plot實驗中，改變探針與Mg2+的濃度，但維持兩者的總濃度恒定，通過Job’s plot曲線分析配位比。結果如圖6所示，發現熒光強度最高點所對應的 [Mg2+]/([Mg2+]+[L] )的量比為0.5，這充分證明了探針與Mg2+的配位比為1∶1。這一結論與滴定曲線的結果是一致的。

圖6 探針與Mg2+的Job’s plot 曲線

3.6 檢測限的測定

檢測限反映了探針識別金屬離子的靈敏度，是考察探針優劣的重要指標。在實驗中，先向石英比色皿中加入2 mL的MeOH∶H2O=1∶1(V∶V)溶液，再加入5 μL探針儲備液，然后每次加入0.4 μL的濃度為1.0×10-3mol/L的Mg2+儲備液，記錄下每次測試的熒光強度，并擬合曲線。如圖7

圖7 探針對Mg2+的檢測限

所示，擬合線性方程為y=69.5786x+ 59.4125，線性相關系數為R2=0.996 7。檢測限可由公式D=3σ/k得到，其中σ表示經幾次測量的探針空白溶液的熒光強度的標準偏差，k則為擬合線性曲線的斜率。經計算得出檢測限為7.3×10-8mol/L，即探針檢測到Mg2+的最低濃度為7.3×10-8mol/L。

3.7 反應機理的探討

該探針以香豆素為熒光團，探針分子中的雜原子N、O參與了與Mg2+的配位作用，Job’s plot和熒光滴定實驗證明了探針與Mg2+是按1∶1配位的。反應機理如圖8所示，在未加入Mg2+之前，探針分子中Schiff堿的N原子上的孤對電子向香豆素基團轉移電子，因而在激發態的探針分子只有微弱的熒光；當探針與Mg2+結合以后，由于N原子參與了配位作用，N原子上的孤對電子不再發生轉移，此時激發態的探針分子與Mg2+配位后就會發出很強的熒光。

圖8 探針與Mg2+的反應機理

4 結 論

本文設計合成了一種新型的基于Schiff堿結構的香豆素類Mg2+熒光探針，該探針經光譜實驗表明在識別Mg2+的過程中，具有很好的離子選擇性和抗干擾性，探針與Mg2+是依據1∶1的比例配位而形成配合物的，探針檢測Mg2+的檢測限為7.3×10-8mol/L，因而具有良好的靈敏度。探針識別Mg2+的過程是具有可逆性的。反應機理反映了探針與Mg2+配位后發出強熒光是由于N原子配位后不能夠向香豆素基團轉移電子造成的。以上實驗結果說明合成的新型Mg2+熒光探針性能良好，為生命科學等領域實時監測Mg2+的情況提供了可靠的實驗保證。