遮陰條件下冬小麥材料生長發育特性相關基因分子鑒定

哈力旦·依克熱木,黃天榮,周安定,高永紅,方 輝,范貴強,吳新元

(新疆農業科學院糧食作物研究所 烏魯木齊，830091)

0 引 言

【研究意義】近年來新疆南疆環塔里木盆地，“果糧間作”已成為當地小麥主要種植模式。果糧間作農田林網化雖有利于提高土地利用率和經濟效益[1]，但與糧爭地、與糧爭光的現象在一定程度上影響了糧食生產, 尤其是矮生的小麥經常受到間作果樹的遮陰, 而影響產量和品質[2-3]。小麥對環境具有很強的適應能力。春化基因(Vrn)，光周期控制基因(Ppd)及千粒重相關基因(Tasus，TaCwi)是反應小麥生長發育特性及產量的一類基因，研究南疆小麥材料中生長發育特性相關基因的等位變異組成和分布，對選育耐陰冬小麥品種有實際意義。小麥屬于喜光喜溫作物。許多小麥品種在短日照地區不能正常抽穗，即使抽穗也會出現穗子變小、穗粒數減少等現象。“果糧間作”模式下，由于果樹遮陰必然影響小麥產量，同時由于生長環境的改變，造成果樹下種植的小麥易發生倒伏、銹病、白粉病、籽粒飽滿度差等現象。對小麥品種資源在遮陰條件下進行鑒定，篩選出耐陰或者對光照不敏感的品種(系)。鑒定和評價耐陰冬小麥的主要生長發育特性基因，對比新疆及國內其他耐陰小麥遺傳背景和基因分布狀況。【前人研究進展】有研究發現，抽穗越早的品種，其成熟時間也越早[4]。春化特性是小麥適應不同氣候條件決定性的因素，其既影響小麥的種植范圍，也決定了小麥的適宜播期內開花期的時間，是植物生長過程的關鍵步驟。小麥春化效應研究是個復雜過程，不同品種春化反應除了和春化基因的顯隱性有關，植物生長到一定的程度后，開花的相關基因也會表達，影響小麥的熟期和產量。有效穗數，穗粒數，千粒重作為重要的產量構成因素，對產量的影響很大。對產量和千粒重研究表明，穗數一定的條件下，熟期越早的品種千粒重越高，但產量卻不一定高[5]。早熟品種的產量不一定高，主要由于早熟品種的灌漿期短，強度低，持續時間短而造成的。光周期反應也是影響小麥生理狀態的重要原因之一。短日照能夠延緩光周期的通過，延長穗的發育，有利于穗大粒多。小麥1BL/1RS易位系由于具有矮稈、高抗和豐產等特性(Yuet al,2012)，在小麥育種中應用廣泛。但該易位系可使面團的吸水性和水溶性提高，造成面團發粘(Graybosh, 2001)，致使品種的加工品質普遍較差。【本研究切入點】南疆“果麥間作”模式小麥種植，約占該區域小麥種植面積的61.27%。利用已開發的1Bl/1RS、Vrn-A1、Ppd-D1、TaSus2、TaCwi分子標記，對南疆冬小麥品種及種質資源的主要生長發育特性基因進行分子標記鑒定。近年來，探索“果糧間作”模式下小麥品種選育和生長發育規律研究取得了明顯成效，部分品種(系)已在常規大田示范和“果麥間作”大田示范中均表現良好。對遮陰條件下的小麥光合生理特性的研究較多，但研究目標相對單一，對耐陰小麥遺傳特性及背景研究未見報道。研究耐陰小麥生長發育機理和遺傳特性。篩選耐陰小麥品種及種質材料。【擬解決的關鍵問題】對70份南疆主栽及部分育成品種、國內引進品種的主要生長發育特性有關基因進行分子鑒定分析。為新疆“果糧間作”模式下耐陰小麥種質資源鑒評和新品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

所用小麥材料均來自新疆農業科學院糧食作物研究所南疆冬麥課題組，共70份，主栽和自育品種4份，引進品種(系)66份，主要來源于河南、山東、河北等黃淮麥區。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取

用CTAB方法，籽粒(約2～3粒)充分研磨后分別放入2.0 mL離心管；加入1.0 mL CTAB提取液(20 g CTAB，1M Tris-HCl (pH 8.0)100 mL，0.5M EDTA(pH 8.0)100 mL，5M NaCl 280 mL)，用蒸餾水定容至1 000 mL，滅菌后加 β-巰基乙醇至10 mM)，置于65℃水浴30 min,水浴過程中混勻數次；然后在4℃下12 000 r/min離心15 min；移上清至一新的2.0 mL離心管中，加入等體積的酚/氯仿(1∶1)，輕搖5～10 min；4℃下12 000 r/min，離心15 min；移上清至一新的1.5 mL離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，輕搖5～10 min；4℃下12 000 r/min，離心10 min；移上清至一新的1.5 mL離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇沉淀DNA，置于-20℃冰箱30 min；4℃下12 000 r/min，離心15 min，去上清，加0.5 mL乙醇(70%)，靜置5 min；4℃下12 000 r/min，離心5 min，去乙醇(70%)，室溫干燥后，溶于400 μL的1×TE中備用。

1.2.2 特異性分子標記引物序列(5’～ 3’)

利用已開發的1Bl/1RS分子標記 F-5′ACCTTCCTCATCTTTGTCCTR-3′CCGATGCCTATACCACTACT、F-5′CCTTCCTCATCTTTGTCCTC、R-3′GCTCTGGTCTCTGGGGTTGT ; Vrn-A1位點F-5′AGCCTCCACGGTTTGAAAGTAA、R-3′AAGTAAGACAACACGAATGTGAGA ;vrn-A1 位點F-5′GCACTCCAACCCACTAACC、R-3′TCATCCATCATCAAGGCAAA ; Ppd-D1位點F-5′ACGCCTCCCACTACACTG、R-3′TGTTGGTTCAAACAGAGAGC,CACTGGTGGTAGCTGAGATT；TaSus2基因F-5′TAAGCGATGAATTATGGCR-3′GGTGTCCTTGAGCTTCTGG/F-5′CTATAGTATGAGCTGGATCAATGGC R-3′GGTGTCCTTGAGCTTCTGA ;TaCwi-A1基因F-5′GGTGATGAGTTCATGGTTAAT, R-3′AGAAGCCCAACATTAAATCAAC 、F-5′GTGGTGATGAGTTCATGGTTAAG R-3′AGAAGCCCAACATTAAATCAAC.

PCR體系20 μL，含模版DNA 3 μL，TaqDNA polymerase(2.5 μ/μL)酶(北京天根生化科技公司)，上下游引物(5 μL/L)各1.0 μL，用ddH2O補充反應體系至20 μL。反應程序為：95℃預變性5 min，94°變性30 s，56°退火1 min，72°延伸1 min，35個循環，72℃延伸10 min；PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用緩沖體系0.5×TBE溶液， 200V電壓電泳45 min，0.5%溴化乙錠(Ethidium bromide，EB)染色10 min，蒸餾水漂洗后在Gel Doc XR System成像系統上用紫外燈掃描成像并存入計算機。分析特異性條帶。

2 結果與分析

2.1 1Bl/1RS易位系的分布

利用ω-sec-p1-p2、ω-sec-p3-p4標記檢測1Bl/1RS易位系位點，可擴增獲得2種片段，ω-sec-p1-p2擴增出1 076 bp的片段，ω-sec-p3-p4擴增出400 bp的片段。擴增出條帶清晰，重復性好。通過分析結果表明：ω-sec-p1-p2在其他國內品種的頻率為59%，70分材料全含著ω-sec-p3-p4類型，參試材料抗病性普遍較好。表1，圖1,圖2

表 1 供試材料在生長發育有關基因分布頻率
Table 1 Distribution frequency of genes related to growth and development of tested materials by molecular markers

來源Origin材料數Accession numbersec-p1/p2(%) sec-p3/p4(%) Vrn-A1c(%)vrn-A1(%)Ppd-D1a(%)Hap-H(%)Hap-L(%)CW121(%)CW122(%)主栽及部分育成品種 Main and some of newly bred variety cultivars 4 25 100 75 100 100 0 75 75 75其他國內品種 Other Chinese cultivars 66 59 100 98.4 72.7 100 43.9 27.2 48.4 75.7 合計 Total 70 57.1 100 97.1 74.2 100 41.4 30 50 75.7

注:供試材料中生長發育相關基因的分布情況

Frequency of Growth and Development genes in main and Other wheat cultivars

圖1 基因類型(Genotype)
Fig.1 Frequency of Growth and Development genes in main and Other wheat cultivars

注：(左圖)冬小麥品種1Bl/1RS易位系的PCR結果圖；M為DNA Ladder 600(600,500,400,300,200,100 bp)(1：鄭麥7698；2：開麥21號；3：周麥32；4：濟麥1號；5：中育9398；6：中育6號；7：鄭麥379；8：開麥18；9：新原958;10：新冬20號;11:新冬40號;12:新冬57號;13:新冬60號;14:豐舞981;15:平安6號;16:新麥21號)(右圖)冬小麥品種1Bl/1RS易位系的PCR結果圖；M為DNA Ladder 2 000(2 000,1 000,750,500,250,100 bp)(1：鄭麥-9694；2：新麥11號；3：浚2016；4：安麥-7號；5:平安8號;6:溫9519;7:渾麥-8號;8:鄭366;9:鄭農17號)

Note：(left)PCR products result map of 1Bl/1RS in winter wheat; M:DNA Ladder 600(600,500,400,300,200,100 bp)

Note:(left);M:DL 600;1:Zhengmai 7 698;2:Kaimai21;3:Zhoumai32;4:Jimai1;5:Zhongyu 9 398;6:Zhongyu6;7:Zhengmai379;8:Kaimai18;9:Xinyuan 958;10:Xindong 20;11:Xindong 40;12:Xindong 57;13:Xindong60;14:Fengwu981;15:Pingan6；16：Xinmai21 Note: (right);M:DL2 000;1:Zhengmai-9 694;2:Xinmai11;3:Jun2 016;4:Anmai-7;5:Pingan8;6:Wen 9 519;7:Hunmai-8;8:Zheng366;9:Zhengnong17

圖2 特異性 PCR標記1Bl/1RS易位系對供試材料的擴增結果
Fig. 2 PCR products amplified by specific PCR labeled 1Bl/1RS in the tested materials

2.2 春化基因的分布

利用Vrn-A1c，vrn-A1標記，檢測Vrn-A1等位基因，攜帶Vrn-A1c的材料能擴出734 bp的片段，為大片段缺失型，攜帶vrn-A1的材料能擴出1 068 bp，為無大片段缺失類型。對供試材料進行檢測，其他國內材料98.4%、主栽和自育品種75%含有Vrn-A1c基因類型，4份主栽品種的全部、其他國內品種72.7%含有vrn-A1類型。Vrn-A1c基因類型在國內品種占主位，分布頻率為98.4%，為弱春性材料；vrn-A1基因的頻率為100%，南疆主栽品種占主位，為半冬性材料。表1，圖3

注：冬小麥品種Vrn-A1c(左)的PCR結果；M為DNA Ladder 2 000( 2 000,1 000,750,500,250,100 bp)(左)(1:新18;2:新麥11號;3:新麥9號;4:鄭麥9023;5:許科718;6:周麥24;7:眾麥998;8:偃高1號;9:許科15)(右)vrn-A1(1:鄭麥-9694;2:新麥11號;3:浚2016;4:安麥-7號;5:平安8號;6:鄭366;7:鄭農17號;8:周麥22號;9:天禾3號;10:新麥13號;11:洛麥-22;12:予麥34)

Note:PCR products result map of Vrn-A1c in winter wheat;( left);M: DNA Ladder 2，000( 2，000,1，000,750,500,250,100 bp)

Note;(left);M;DL2，000;1:Xin18;2:Xinmai11;3:Xinmai9;4:Zhengmai9023;5:Xuke718;6:Zhoumai24;7:Zhongmai998;8:Yangao-1;9:Xuke15 Note;(right) ;M;DL2，000;1:Zhengmai-9694;2:Xinmai11;3:Jun2016;4:Anmai-7;5:Pingan8;6:Zheng366;7:Zhengnong17;8:Zhoumai22;9:Tianhe3;10:Xinmai13;11:Luomai-22;12:Yumai34

圖3 特異性 PCR標記Vrn-A1對供試材料的擴增結果
Fig. 3 PCR products amplified by specific PCR labeled Vrn-A1 in the tested materials

2.3 Ppd-D1基因分布

利用Ppd-D1a、Ppd-D1b標記，檢測Ppd-D1等位基因，攜帶Ppd-D1a的材料能擴出288 bp的片段，為光周期非敏感型，攜帶Ppd-D1b的材料能擴出414 bp，為光周期敏感性類型。對供試材料進行檢測，未發現Ppd-D1b類型，全含Ppd-D1a類型，為光周期非敏感性材料。表1，圖4

注：冬小麥品種Ppd-D1的PCR結果圖；M為DNA Ladder 2 000( 2 000,1 000,750,500,250,100 bp)

Note : PCR products result map of Ppd-D1 in the winter wheat (left);M: DNA Ladder 2 000( 2 000,1 000,750,500,250,100 bp)

(1:予展4號;2:新麥19;3:許農5號;4:予保1號;5:鄭麥7698;6:開麥21號;7:周麥32;8:濟麥1號;9:中育9398;10:中育6號;11:鄭麥379;12:開麥1813:新原958)

Note:M:DL2，000;1:Yumai4；2：Xinmai19；3：Xunong5；4：Yubao-1；5：Zhengmai7698；6：Kaimai21；7：Zhoumai32；8：Jimai1；9：Zhongyu9398；10:Zhongyu 6;11:Zhengmai379;12:kaimai1813；13：Xinyua:958

圖4 特異性 PCR標記Ppd-D1對供試材料擴增結果
Fig. 4 PCR products amplified by specific PCR labeled Ppd-D1 in the tested materials

2.4 TaSus2基因的分布

利用Hap-H 、Hap-L標記，檢測TaSus2等位基因，攜帶Hap-H的材料能擴出423 bp的片段，為高千粒重材料，攜帶Hap-L的材料能擴出381 bp的片段，為低千粒重材料。對供試材料進行檢測，其他國內引進品種的43.9%為高千粒重材料，主栽及部分育成品種中75%為低千粒重材料。其他國內引進品種占主位。表1，圖5

注：冬小麥品種Hap-H(左)的PCR結果圖；M為DNA Ladder 600(600,500,400,300,200,100 bp)(1:溫9519;2:渾麥-8號;3:平安8號;4:鄭366;5:新麥12號;6:新麥13號)Hap-L(右)；(1:安麥-1號;2:浚2016;3:天禾3號;4:眾麥998;5:偃高1號)

Note :PCR products result map of Hap-H in the winter wheat (left);M: DNA Ladder 600(600,500,400,300,200,100 bp)

Note;(left);M:DL600;1:Wen9519;2:Hunmai-8;3:Pingan-8;4:Zheng366;5:Xinmai12;6:Xinmai13 Note;(right) M:DL600;1:Anmai-1;2:Jun2016;3:Tianhe3;4:Zhongmai998;5:Yangao-1

圖5 特異性 PCR標記TaSus2對供試材料擴增結果
Fig. 5 PCR products amplified by specific PCR labeled TaSus2 in the tested materials

2.5 TaCwi基因的分布

利用CW122、CW121標記，檢測TaCwi等位基因，攜帶CW122的材料能擴出402 bp的片段，為千粒重較高，攜帶CW121的材料能擴出404 bp的片段，為千粒重較低。對供試材料進行檢測，其他國內引進品種75%為千粒重較高,占主位。主栽品種的48.4%為千粒重較高。表1，圖6

注：冬小麥品種CW122(左)的PCR結果圖；M為DNA Ladder 600(600,500,400,300,200,100 bp)

Note :PCR products result map of CW122 in the winter wheat (left);M: DNA Ladder 600(600,500,400,300,200,100 bp)

(1:渾麥-8號;2:安麥-1號;3:新麥11號;4:鄭366;5:洛麥-22;6:予麥34;7:新18;8:新麥9號;9:許科718)CW121(右)(1:周麥22號;2:天禾3號;3:許科718;4:周麥24;5:周麥16(中育1326);6:開麥20;7:項麥969;8:偃展4110)

Note(left);M;DL600;1:Hunmai-8;2:Anmai-1;3:Xinmai-11;4:Zheng366;5:Luomai-22;6:Yumai34;7:Xin18;8:Xinmai9;9:Xuke718Note(right);M;DL600;1:Zhoumai22;2:Tianhe3;3:Xueke718;4:Zhoumai24;5:Zhoumai16(Zhongyu1326);6:Kaimai20；7：Xiangmai969；8：Yanzhan4110

圖6 特異性 PCR標記TaCwi對供試材料擴增結果
Fig. 6 PCR products amplified by specific PCR labeled TaCwi in the tested materials

3 討 論

小麥對低溫的敏感性越低，越冬性越強。反而低溫的敏感性越高，越冬性越弱[6]。實驗結果表明，70份供試材料對光照環境具有廣泛的適應性，均表現為光周期非敏感類型。在主栽品種與國內引進品種的生長特性有一定的差異。國內品種大部分攜帶Vrn-A1c顯性春化基因，一致性為98.4%，為春性或弱春性品種，而主栽品種含有vrn-A1全陰性春化基因，為半冬性品種，與Zhao等[7]研究結果一致，既保證了該生態區小麥的早熟性，又兼顧了品種的越冬能力。南疆主栽及部分育成品種春性特性低于國內品種。由于小麥春化反應的復雜性和多樣性，國內外學者從不同角度和層次對其進行了研究[8-11]。春化基因控制著小麥品種的冬春特性，但也有研究發現僅用春化基因來預測品種的冬春性還不完善，分子檢測與田間觀察相結合才能夠更準確地反映品種的冬春性[12,13]。大部分供試材料攜帶1BL·1RS染色體，不但具有抗性基因，而且攜帶提高產量，增強對環境適應性的基因。

4 結 論

所有的供試材料含有1BL/1RS (sec-p3-p4)易位系基因并對光周期不敏感。主栽及新育成主栽品種含有隱性春化基因。68份材料同時攜帶光周期非敏感性及顯性春化基因。國內引進品種中與主栽及部分新育成品種的高千粒重類型基因分布率相當高。