棉花PsbS基因對煙草光合特性的影響

曾曉燕，趙瑞海，李志博，魏亦農

(石河子大學農學院/新疆生產建設兵團綠洲生態農業重點實驗室，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】高等植物具有光保護機制，可以減輕光帶來的有害影響，非光化學猝滅(NPQ)是光保護機制之一[1]，PsbS被認為僅存在于高等植物中，通過與天線蛋白的相互作用來激活NPQ[2]，研究PsbS基因在光系統II中的功能對今后選育高光效棉花品種具有現實意義。【前人研究進展】有研究表明，通過表達調節QA氧化還原狀態，影響氣孔導度和葉片的水分利用效率[3]；過量表達PePsbS1和PePsbS2的轉基因擬南芥植物均顯示出增強的光保護作用，而且PePsbS1和PePsbS2的表達還可以恢復擬南芥npq4突變體的NPQ[4]。已經對該基因在棉花中進行了克隆和功能初步分析[5]，該基因能響應多種脅迫及不同的光照處理。【本研究切入點】該基因相關研究主要集中在熒光特性方面，而光合方面研究則相對較少。研究比較煙草中過量表達PsbS株系與野生型的表型差異。【擬解決關鍵問題】比較煙草中過量表達PsbS株系與野生型的光合相關參數，研究棉花PsbS基因在光保護中作用機制。對PsbS基因在棉花中的具體功能進行了進一步驗證。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗三個純系(3個純合株系L1、L2、L3)已克隆完成的過表達載體pGWB17-GhPsbS，及已轉化完成的T2代過量表達PsbS煙草、普通野生型煙草(WT)，種植在新疆兵團綠洲生態農業重點實驗室人工氣候室。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

選擇三個煙草株系L1、L2、L3種子均勻點播在1/2 MS培養基中。25～30 d，采用盆栽試驗，將幼苗移栽入花盆中，以基質和蛭石按3∶1比例混合裝入直徑為15 cm、高12 cm 的花盆，每盆移栽一株，轉基因煙草(3個純合株系L1、L2、L3)與野生型煙草各移種9盆，放入人工氣候室生長，定期澆適量的水，人工氣候室光照為240 μmol/(m2·s)，溫度為20℃。

生長期間不定期測量各株系的葉面積；當第7片葉完全展開時，取樣測葉綠素含量；在光照培養箱進行不同光強處理：75(較低光強)、240 (正常光強)、450 μmol/(m2·s)(較高光強)，4 h后采用LI-6400 型便攜式光合系統儀(美國Li-cor公司)測量各株系間的光合特性。

1.2.2 轉基因植株PCR鑒定

根據改良的CTAB法提取抗性植株的葉片DNA[6]，設計PsbS特異引物F：5'-CACCATGGCTCAAACAATGCTGGTAAT-3'，R：5'-GTCTTCTTCCGCTTCAT

CAGTAAC-3' (由上海捷瑞生物工程有限公司合成)。利用該對引物，以提取的煙草DNA為模板進行 PCR 擴增。其條件為 94℃預變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個循環；72℃延伸10 min；16℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統下檢測PCR產物，驗證為陽性植株的用于后續實驗。

1.2.3 葉面積測定

不同生長時期用長寬法測定煙草葉片葉面積[7]，計算葉面積(葉面積/cm2=0.707 5×長×寬)，轉基因3個株系與野生型各隨意選取5株，每株選擇最大葉長寬。

1.2.4 葉綠素( Chl) 及類胡蘿卜素含量測定

參考張蜀秋等[8]的方法并有所改進，采用直接浸提法，避開葉脈取葉片圓片用80%的丙酮溶液提取(葉片1.1 cm打孔器4片稱重+13 mL丙酮溶液)，試管用黑布遮住置于黑暗室溫條件下放置72 h，期間搖動數次至各綠色器官圓片呈白色時，取其上清液用U-5100 UV/VIS 型分光光度計(日本)于663、645和470 nm波長下比色，用80%丙酮作空白對照。每個株系及野生型煙草取5株的平均值為測定值。計算出提取液中葉綠素a和葉綠素b的含量，葉綠素含量計算公式如下(Lichtenthaler，1983)：

葉綠素a的含量(mg/g)= (12.21D663-2.81D646)×V/W.

葉綠素b的含量(mg/g)= (20.13D646-5.03D663)×V/W.

類胡蘿卜含量(mg/g)=(1 000D470 - 3.27C(Chla)- 104C(Chlb))/229.

式中D663、D645、D470 分別為相應波長下的光密度值，V為提取液體積，W為所取葉片鮮重。

1.2.5 光合特性測定

人工氣候箱溫度設為28℃，濕度為37%，75、240、450 μmol/(m2·s)三個光強下轉基因株系各3株，野生型3株。儀器使用開放式氣路，內置光源，測定轉基因各植株凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導度(Gs)等指標。測定時選擇植株相同葉片，選取大致相同的部位，最后取各株系的平均值與野生型進行比較。

1.3 數據處理

原始數據采用Microsoft Excel 2010 軟件，分別計算平均值和標準誤差，并繪制圖表。采用統計軟件SPSS 19.0 進行顯著性分析，圖中小寫字母和“*”表示轉基因與野生型煙草在P< 0.05水平上差異顯著。

2 結果與分析

2.1 轉基因植株的獲得

分別提取野生型和抗性株系的 DNA，以PsbS基因引物進行PCR擴增，在轉化株系中都分別擴增出預期目的條帶，在野生型煙草植株中未擴增出目的條帶，已驗證植株為轉基因的用于后續實驗。圖1

注：M：Marker；1～3：轉PsbS基因植株；4：WT；5：陰性對照；6：陽性對照

Note: M:Marker; 1-3: transgenic PsbS gene plants; 4: WT; 5: negative control; 6: positive control

圖1 轉PsbS基因煙草鑒定
Fig. 1 Identification of transgenic PsbS tobacco

2.2 葉面積差異

研究表明，轉PsbS基因煙草生長前期的葉片增長幅度明顯比野生型煙草葉片增長的快。從移栽入土中開始，19～30 d，轉基因3個株系與野生型均差異顯著。第19 d時，轉基因煙草的平均葉面積是普通野生型的2.36倍，22 d時，轉基因煙草的葉面積是普通野生型的2.39倍，而到第30 d時，轉基因煙草的葉面積是普通野生型的1.66倍。移栽前期轉PsbS基因煙草明顯較野生型生長較快，30 d時增長幅度已呈現逐漸下降的趨勢。圖2

與野生型相比，轉PsbS基因的煙草前期葉片明顯偏大，而到40 d左右差異逐漸減小。該基因在某種程度上促進了煙草葉片前期的快速生長。圖3

圖2 轉PsbS基因煙草與野生型煙草不同時期葉面積比較
Fig. 2 Comparison of Leaf Areas between TransgenicPsbSGene and Wild Type Tobacco in Different Periods

圖3 轉基因煙草與野生型煙草生長狀況
Fig. 3 Growth status of transgenic tobacco and wild type tobacco

2.3 轉PsbS基因煙草株系葉綠素及類胡蘿卜素含量

研究表明，轉基因株系L3的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量與普通野生型差異都極顯著，L3的葉綠素a和葉綠素b含量分別是普通野生型的1.39倍和1.62倍，且其類胡蘿卜素含量比普通野生型高了37%，L1和L3的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量與普通野生型雖沒有太大差異，但均高于普通野生型。而葉綠素a/b含量有所不同，普通野生型的含量顯著高于轉基因兩個株系。轉PsbS基因能夠提高煙草的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。圖4

注：A:葉綠素a; B:葉綠素b; C:類胡蘿卜素; D:葉綠素a/b

Note: A: chlorophyll a; B: chlorophyll b; C: carotenoid; D: chlorophyll a/b

圖4 轉基因煙草株系葉綠素和類胡蘿卜素含量
Fig. 4 The strain of transgenic tobacco chlorophyll and Carotenoid content

圖5 轉基因煙草各株系不同光強下的凈光合速率
Fig. 5 Net photosynthetic rate of different lines of transgenic tobacco under different light intensities

2.4 轉PsbS基因煙草的光合特性

2.4.1 凈光合速率(Pn)的影響

研究表明，三個株系(L1、L2、L3)與野生型(普通野生型)間差異顯著；在與生長光照相同的240 μmol/(m2·s) 光照處理后，三個株系均與普通野生型存在顯著差異，株系L3的光合速率是普通野生型的3倍，而株系L1、L2的凈光合速率則是普通野生型的2倍，同時轉基因株系間也存在差異；低光強75 μmol/(m2·s)下光合速率雖然都有所下降，但轉基因株系的凈光合速率還是高于野生型的光合速率，較高光強450 μmol/(m2·s)下L1、L2轉基因株系的光合速率比240 μmol/(m2·s)明顯有所升高。

2.4.2 氣孔導度(Gs)的影響

轉基因株系L3在240 、450 μmol/(m2·s)光強下的氣孔導度與野生型間差異顯著，分別是普通野生型的2.26、1.46倍；雖然株系L1、L2在三個光強處理下與野生型間無差異，但轉基因三個株系在不同光強下氣孔導度均略高于野生型煙草的氣孔導度。圖6

圖6 轉基因煙草各株系在不同光強下的氣孔導度
Fig. 6 Stomatal conductance of transgenic tobacco lines under different light intensities

2.4.3 胞間CO2濃度(Ci)的影響

研究表明，不同光強處理后，野生型普通野生型的胞間CO2濃度明顯比轉基因株系的Ci高，但二者間的胞間CO2濃度無顯著差異。當處理光強為75 μmol/(m2·s)時，只有轉基因株系L2與普通野生型差異顯著，且普通野生型的Ci是株系L2的1.3倍，分別比L1、L3高了15%、18%；而與生長光強一致的240 μmol/(m2·s)和較高光強(450 μmol/(m2·s))處理后，轉基因各株系與普通野生型間雖無顯著差異，普通野生型的Ci高于轉基因株系。圖7

圖7 轉基因煙草各株系在不同光強下的胞間CO2濃度
Fig. 7 Intercellular CO2concentration of transgenic tobacco lines under different light intensities

2.4.4 蒸騰速率(Tr)的影響

研究表明，盡管轉基因三個株系的Tr均比野生型的Tr較高，但是只有株系L3的Tr在240、450 μmol/(m2·s)光強處理后與普通野生型存在明顯差異，較低光強75 μmol/(m2·s)處理后，三個株系的蒸騰速率整體均比野生型略高，但之間差異不顯著；而240 μmol/(m2·s)處理后，株系L3的蒸騰速率Tr是野生型煙草蒸騰速率的2.28倍，株系L1、L2與普通野生型無明顯差異；450 μmol/(m2·s)處理后，株系L3的Tr是普通野生型的1.4倍，而株系L1、L2的Tr則分別比普通野生型高了5%、13%。圖8

圖8 轉基因煙草各株系在不同光強下蒸騰速率
Fig. 8 Transpiration rate of each line of transgenic tobacco under different light intensities

2.4.5 水分利用效率(WUE)的影響

研究表明，240 μmol/(m2·s)處理下三個轉基因株系與普通野生型相差較大，但只有株系L1與普通野生型存在顯著差異；較低光強(75 μmol/(m2·s))下，L3的WUE與普通野生型差異顯著；較高光強(450 μmol/(m2·s))處理下，株系L3則出現了水分利用效率比普通野生型 低的情況，且各株系與普通野生型的差異也逐漸縮小，水分利用效率WUE=Pn/Tr ，即單位葉面積上葉片的凈光合速率與蒸騰速率之比，不同光強處理下，水分利用效率出現明顯差異，正常光強(240 μmol/(m2·s))轉基因株系與普通野生型的相對差異較大，而較低光強(75 μmol/(m2·s))和較高光強(450 μmol/(m2·s))下，轉基因株系與普通野生型的相對差異較小。圖9

圖9 轉基因煙草各株系與普通野生型的水分利用效率相對差異
Fig. 9 Relative difference in water use efficiency between transgenic tobacco lines and wild-type

3 討 論

3.1 轉PsbS基因對煙草葉綠素含量的影響

有研究表明[9]植物會通過改變形態特征或生物量分配來提高生存適合度與競爭力，葉片作為煙草光合作用的基礎，其較大的生物量有利于煙草捕獲光能，維持光合作用的高速運轉，從而避免因光能過剩形成的光抑制[10]。研究中，生長前期轉基因煙草的葉片比野生型增長較快，與水稻中PsbS缺陷的植株在苗期顯示出生長遲緩，并且在生殖階段的適應性降低[11]等結果相一致，這樣使轉基因植株更快速的捕獲光能，導致了后期對葉片葉綠素含量及光合產生了影響。

反應中吸收利用光能的主要色素-葉綠素與光合速率之間有著密切的關系[12]，除少數特殊狀態下的葉綠素a分子作為作用中心色素外，其余的葉綠素a和葉綠素b均為聚光色素[13]。在一定范圍內，葉綠素含量的增加可以增強葉綠體對光能的吸收與轉化，進而增強光合速率。因此，葉片中葉綠素含量的高低是反映植物光合能力的一個重要指標[14]。研究結果發現，轉基因株系葉綠素a、b含量與野生型煙草間差異顯著，PsbS基因導入煙草后在葉片中得到了表達使轉基因煙草株系的葉綠素含量增加，延緩了功能葉片的衰老。

3.2 不同光強對轉基因煙草光合的影響

PsbS蛋白是光系統II處結合葉綠素結合蛋白[15,16]。PsbS蛋白之所以被認為在能量耗散中起著關鍵性的作用[17]，主要是強光照導致類囊體膜的酸化[18]；正是因為PsbS感受了類囊體膜腔的酸度變化[19,20]進而引起qE以及葉黃素循環來起到光保護的作用。作為能態淬滅產生的關鍵蛋白之一，它是光系統II超級復合體的蛋白組分之一，更是耗散過剩光能不可或缺的部分，在葉綠體熒光的非光化學淬滅(non-photochemical quenching, NPQ)中發揮著重要作用[17]。光合速率是表示植物在單位面積在單位時間內的 CO2吸收量，或者是 O2釋放量，通常情況下植物光合速率值越高，說明植物的生理狀態越好[21]，實驗對轉PsbS基因的煙草植株進行了光合速率的測定，發現不同光強下轉基因煙草的凈光合速率普遍都比野生型煙草的高，結果表明,轉基因的煙草促進了葉片的生長，與 Zhang M等[22]的研究結果一致，在東南景天中，超表達SaPsbS基因能夠促進煙草的生長，并且能增加煙草的Fv/Fm值，相反的，擬南芥突變體npq4由于缺失PsbS基因而導致植物生長受抑制[23]，由于PsbS在高等植物中的作用是普遍的，因此，這種操作應該對所有作物都有效，可能為提高作物產量和品質提供了巨大潛力[3]。

試驗中在光強度一定的情況下，隨著光照時間的延長，在適宜植株生長的4 h時達到光合最高，這印證了高志民等[24]的毛竹PsbS基因在41℃下誘導4 h的表達效果最好,誘導時間明顯影響PePsbS基因的表達，隨后降低，趨于平衡。同時通過比較不同光強處理下的轉PsbS基因煙草光合性能指標表明，在較低光條件下生長的煙草，凈光合速率(Pn)較低，胞間CO2濃度(Ci)較高，氣孔導度(Gs)較低，說明煙草葉片對CO2同化不能與光能吸收相協調，在光能捕獲不足的情況下最終引起Pn下降；在光合速率較低的情況下通過減少水分的散失從而來適應弱光環境[14]，試驗中轉基因株系在較低光強下(75 μmol/(m2·s))與正常生長條件(240 μmol/(m2·s))的水分利用效率相比，表現出明顯的下降趨勢，較高光強(450 μmol/(m2·s))與之相比，同樣出現明顯下降趨勢，可以猜想，隨著光照強度的增加(>450 μmol/(m2·s))，轉基因株系的水分利用效率會逐漸升高，與普通野生型的相對差異會逐漸呈現反向增長狀態，具體情況有待進一步研究。而蒸騰速率(Tr)的下降可能與氣孔的閉合有關，轉基因煙草株系比野生型煙草有較高的氣孔導度和蒸騰速率，使其能維持較高的光合速率和積累更多的光合作用產物為結實提供需要。

4 結 論

轉GhPsbS基因的煙草苗期葉面積的增長比野生型煙草快，移栽后19、22、26和30 d轉基因株系的平均葉面積分別是普通野生型的葉面積的3.57、3.54、2.64、2.72倍，再次驗證了該基因能促進植株的生長，且葉綠素a、b含量間也存在顯著差異，普通野生型的葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量分別為0.417、0.1743、0.708，而轉基因株系的葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量分別為0.689、0.223、0.845，較普通野生型分別增長了65%、56%、19%；光合特性方面，轉GhPsbS基因的煙草表現出了增強的光合特性，不同光照強度下，轉GhPsbS基因株系的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)和氣孔導度(Gs)均高于野生型煙草。在較高光強450 μmol/(m2·s)條件下，轉基因株系的Pn較普通野生型分別高了11.5%、13.7%、30.1%，轉基因株系的Tr分別為1.37、1.47、1.82，普通野生型的Tr為1.30，同時轉基因株系的Gs分別為0.047、0.054、0.064，比普通野生型分別高了6.8%、22.7%、45.5%。綜上說明轉GhPsbS基因煙草較野生型具有較強的光合能力。實驗的結論與田間試驗存在明顯差異，驗證轉入該基因的棉花的具體功能時，選擇田間試驗更具有可靠性。