植物乳桿菌和含水量對辣木葉青貯品質(zhì)和單寧含量的影響

王成，王益，周瑋，駢瑞琪，張慶*，陳曉陽*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東 廣州510642;2.華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院，廣東木本飼料工程技術研究中心，廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東廣州510642)

目前，我國傳統(tǒng)蛋白質(zhì)飼料資源嚴重短缺且價格昂貴，蛋白飼料主要依賴于進口，這已成為制約畜牧業(yè)發(fā)展的主要因素。因此，尋求價廉、高產(chǎn)和高效的新型蛋白飼料，以期完全或部分替代傳統(tǒng)蛋白飼料成為動物營養(yǎng)學研究的熱點。辣木(Moringa oleifera)是一種起源于印度北部的熱帶、亞熱帶植物，已在我國廣東、廣西、海南、四川和云南等地大規(guī)模種植。其特點是年產(chǎn)量高，鮮重年產(chǎn)量約126 t·hm-2[1]，干物質(zhì)年產(chǎn)量10.4～20.7 t·hm-2[2];蛋白含量高且纖維含量低，Teixeira等[3]研究顯示辣木葉粉中含有28.7%的粗蛋白、7.1%的脂肪、44.4%碳水化合物以及各類維生素和礦物元素，符合優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料的基礎，可以開發(fā)成為一種新型的植物性蛋白質(zhì)飼料[4]。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)，可以將辣木葉作為蛋白來源和飼料組分應用到動物生產(chǎn)中，主要在山羊[5-7]、綿羊[8]以及其他反芻動物[9-10]中，有著積極的效果。但報道使用的多為辣木葉粉，青貯使用較少，辣木葉粉需要經(jīng)過晾干粉碎處理，成本提高，且南方雨水較多，辣木葉粉容易受潮發(fā)霉，增加了處理難度。而青貯調(diào)制不受天氣影響，成本低廉，青貯過程還可以降低原料的抗營養(yǎng)因子[11]，有利于辣木葉的長期保存。乳酸菌作為一種發(fā)酵促進劑，能夠促進青貯初期盡快進入乳酸發(fā)酵階段，促進單糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸，使p H迅速降低，同時抑制蛋白質(zhì)的水解作用，降低氨態(tài)氮(NH3-N)，乙酸(AA)和丁酸(BA)濃度，減少酵母菌和霉菌的滋生[12]。除添加劑外，青貯原料本身的含水量和青貯時間也是影響青貯品質(zhì)的重要因素，含水量太高，青貯過程中會產(chǎn)生大量滲出液，易引起梭菌發(fā)酵;含水量太低，不利于壓實，引起好氧霉變，使營養(yǎng)物質(zhì)大量損失[13-14]。

含水量和添加乳酸菌對于常規(guī)牧草青貯品質(zhì)的影響報道較多，而辣木作為木本植物，通過青貯技術應用于飼料生產(chǎn)的研究鮮有報道。本試驗在不同含水量的青貯辣木中添加乳酸菌，在發(fā)酵60和120 d測定辣木的青貯品質(zhì)和單寧含量，研究乳酸菌添加劑和含水量對辣木葉青貯品質(zhì)的影響，以期為辣木葉的青貯調(diào)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的辣木品種為PKM-1，于云南辣木種子資源庫采種，2016年8月種植于華南農(nóng)業(yè)大學稻香園試驗田，2017年7月采葉，然后進行不晾曬(含水量約為75%)和晾曬3 h(含水量約為70%)，晾曬12 h(含水量約為60%)處理。試驗所用的乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum，LP)，由中國農(nóng)業(yè)大學青貯實驗室研發(fā)。

1.2 試驗設計

本驗采用雙因素完全隨機設計，因素一為添加乳酸菌，添加量為1×106cfu·g-1鮮樣(fresh matter，F(xiàn)M)，將不添加作為對照(CK)組;因素二為含水量，分3個水平，75%(DM1)、70%(DM2)和60%(DM3)。采集新鮮辣木原料，用鍘刀切成3～4 cm的小段后，分別晾曬0、3和12 h后，將植物乳桿菌添加劑噴灑于不同含水量原料上，對照組噴灑等量的蒸餾水，混合均勻后裝到聚乙烯塑料袋(20 cm×30 cm)中，每袋180 g左右，真空封口機除去空氣并密封保存。一共6個組，每組6個重復，共36袋。分別在青貯的60和120 d后開袋，對其化學成分、發(fā)酵品質(zhì)進行測定分析。

1.3 試驗指標測定

1.3.1 營養(yǎng)指標 粗蛋白質(zhì)(CP)測定:凱氏定氮法[15]。

非蛋白氮(non-protein nitrogen，NPN)測定:三氯乙酸溶液混合發(fā)酵后的辣木葉干粉，無損的取定量濾紙過濾后的沉淀，烘干后用凱氏定氮法測定含氮量即非蛋白氮[16]，真蛋白(true protein，TP)，TP=CP-NPN，通過凱式定氮儀分別測定粗蛋白質(zhì)(CP)和非蛋白氮(NPN)。

氨態(tài)氮(NH3-N)測定:苯酚-次氯酸鈉比色法[17]。

游離氨基酸氮(FAA)測定:茚三酮-硫酸肼比色法[18]。

酸性洗滌纖維(ADF)和中性洗滌纖維(NDF)測定:范氏纖維測定法[19]。

1.3.2 發(fā)酵品質(zhì)和微生物數(shù)量 p H值測定:開袋后，取代表性青貯樣品20 g，加入180 m L蒸餾水，混合均勻，經(jīng)家用榨汁機榨汁1 min，依次用4層紗布和中速定性濾紙過濾，得到浸提液，采用p H計(PHS-3C，上海雷磁)測量p H值[20]。

有機酸的測定:浸提液經(jīng)0.22μm孔徑的濾膜過濾得到濾液，采用島津GC-14型高效液相色譜儀(色譜柱:Shodex Rspak KC-811 s-DVB gel column，日本;檢測器:SPD-M10AVP)測定乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)含量，流動相為3 mmol·L-1高氯酸，流速1 m L·min-1;柱溫為50℃;檢測波長為210 nm，進樣量為5μL[21]。

干物質(zhì)和可溶性碳水化合物測定方法:干物質(zhì)(將青貯辣木葉混合均勻后，稱重取樣放在65℃恒溫烘箱中，烘至絕干，計算烘干前后的重量比值，即為干物質(zhì));可溶性碳水化合物(蒽酮比色法測定。制作葡萄糖標準曲線，將樣品煮沸10 min，冷卻過濾定容，經(jīng)吸取搖勻后加入蒽酮，在620 nm波長下比色測定吸光度來測得)。

乳酸菌、酵母菌和大腸桿菌數(shù)量測定:取代表性樣品20 g，加入180 m L滅菌的生理鹽水，均勻混合后逐級稀釋。微生物數(shù)量測定采用平板計數(shù)法，乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌分別采用MRS瓊脂培養(yǎng)基[蛋白胨10.0 g;牛肉浸粉5.0 g;酵母提取物4.0 g;葡萄糖20.0 g;吐溫-80，1.0 m L;磷酸氫二鉀2.0 g;乙酸鈉5.0 g;檸檬酸三銨2.0 g;七水合硫酸鎂0.2 g;四水合硫酸錳0.05 g;瓊脂15.0 g;最終p H值(6.2±0.2)]、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂[VRBA，蛋白胨7.0 g;酵母提取物3.0 g;乳糖10.0 g;氯化鈉5.0 g;膽汁鹽3號1.5 g;中性紅0.03 g;結晶紫0.002 g;瓊脂15.0 g;最終p H值(7.4±0.2)]、孟加拉紅培養(yǎng)基(虎紅瓊脂)(蛋白胨5.0 g;葡萄糖10.0 g;磷酸氫二鉀1.0 g;七水合硫酸鎂0.5 g;瓊脂15.0 g;孟加拉玫瑰紅0.033 g;氯霉素0.1 g)進行培養(yǎng)計數(shù)，乳酸菌用厭氧培養(yǎng)箱，酵母菌和大腸桿菌用生化培養(yǎng)箱，30℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)[22]。

1.3.3 單寧含量測定 水解單寧:用70%丙酮，超聲波處理，離心并收集上清液，用沒食子酸(廣州添資生物科技有限公司，廣州)為標準品繪制標準曲線，采用Folin-Ciocalteu試劑比色法測定總酚和簡單酚含量，總酚減去簡單酚即為水解單寧含量;縮合單寧:20 mg樣品加10 m L丙酮-丁醇-氯化氫試劑，70℃水浴2.5 h，冷卻后8000 r·min-1離心5 min，554 nm測OD值，以原花青素(廣州添資生物科技有限公司，廣州)為標準品制作標準曲線，計算縮合單寧含量[23]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 18.0進行雙因素方差分析(Two-way AVOVA)，兩個因素互作顯著時用Duncan氏對各組進行多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 辣木原料的特性

辣木葉原料CP含量為16.72%，WSC含量較高為10.72%，NDF和ADF分別為31.24%和24.23%，水解單寧和縮合單寧分別是1.86%和1.48%，原料中微生物含量豐富，乳酸菌和大腸桿菌數(shù)量分別是4.63和4.81 log cfu·g-1FM(表1)。

表1 辣木葉原料的特性Table 1 The characteristics of M.oleifera leaves material

2.2 辣木葉青貯60 d指標測定

2.2.1 植物乳桿菌和含水量對60 d青貯辣木葉青貯品質(zhì)的影響 由表2可知，辣木葉青貯發(fā)酵60 d，75%和60%水分組添加LP后，p H值顯著下降(P＜0.05)，70%水分組添加LP后p H值顯著上升(P＜0.05)，70%和60%水分組添加LP后AA和PA含量顯著升高(P＜0.05)，70%水分組添加LP后的LA含量顯著升高(P＜0.05);大腸桿菌的數(shù)量小于2.0 log cfu·g-1FM。方差分析結果表明，水分對于各個指標(ADF、NDF含量和大腸桿菌數(shù)量除外)均有極顯著的影響(P＜0.01)，添加LP對p H值，AA，PA含量和乳酸菌數(shù)量有極顯著的影響(P＜0.01)，對LA含量有顯著的影響(P＜0.05)，二者的交互作用對p H值、乳酸菌數(shù)目，LA和PA含量有極顯著的影響(P＜0.01)。

表2 植物乳桿菌和含水量對60 d辣木葉青貯品質(zhì)的影響Table 2 Effect of moisture and LP treatment on character of silage M.oleifera leaves in 60 d

2.2.2 植物乳桿菌和含水量對60 d青貯辣木葉單寧含量的影響 由表3可知，辣木葉青貯發(fā)酵60 d后，添加LP和3個含水量處理對單寧酸含量均無顯著影響。

表3 植物乳桿菌和含水量對60 d青貯辣木葉單寧含量的影響Table 3 Effect of moisture and LP treatment on the Tannin contents of silage M.oleifera leaves in 60 d(%DM)

2.2.3 植物乳桿菌和含水量對60 d青貯辣木葉營養(yǎng)價值的影響 由表4可知，辣木葉青貯發(fā)酵60 d后，60%含水量組相比于75%和70%水分組，TP含量顯著降低(P＜0.05)，F(xiàn)AA和NH3-N含量顯著升高(P＜0.05);添加LP和3個水分處理對CP含量無顯著影響。70%水分組添LP后，TP含量顯著降低(P＜0.05)，NPN含量顯著增加(P＜0.05)。方差分析結果表明，含水量對于NPN、TP、FAA、NH3-N的含量有極顯著的影響(P＜0.01)，對CP含量有顯著影響(P＜0.05);添加LP對NPN和NH3-N的含量有極顯著的影響(P＜0.01)，對TP含量有顯著影響(P＜0.05);水分和植物乳桿菌的交互作用對NPN有顯著影響(P＜0.05)。

表4 植物乳桿菌和含水量對60 d青貯辣木葉營養(yǎng)價值的影響Table 4 Effect of moisture and LP treatment on nutrition value of silage M.oleifera leaves in 60 d(%DM)

2.3 辣木葉青貯120 d指標測定

2.3.1 植物乳桿菌和含水量對120 d青貯辣木葉青貯品質(zhì)的影響 由表5可知，60%含水量組相比于75%和70%水分組，LAB數(shù)目顯著降低(P＜0.05)，AA、PA、NDF和ADF含量顯著升高;各個水分組添加LP后p H值和酵母菌數(shù)目均降低但并不顯著，75%和70%含水量組添加LP后LAB數(shù)目顯著降低(P＜0.05)，70%含水量添加LP后LA含量顯著升高(P＜0.05)并且各個水分組的AA和PA含量均有顯著升高(P＜0.05);在75%和70%含水量下添加LP后NDF和ADF含量顯著升高(P＜0.05)。方差分析結果表明，水分對LAB數(shù)目，PA、NDF和ADF含量有著極顯著的影響(P＜0.01)，對LA和AA含量有顯著影響(P＜0.05);添加LP對p H值以及AA和PA含量有極顯著影響(P＜0.01)，對LAB數(shù)量，LA、NDF和ADF含量有顯著影響(P＜0.05)，二者的交互作用對p H值有極顯著影響(P＜0.01)。

表5 植物乳桿菌和含水量對120 d青貯辣木葉青貯品質(zhì)的影響Table 5 Effect of moisture and LP treatment on character of silage M.oleifera leaves in 120 d

2.3.2 植物乳桿菌和含水量對120 d青貯辣木葉單寧含量的影響 由表6中方差分析結果表明，水分以及二因素的交互作用對水解單寧含量有極顯著影響(P＜0.01)。

表6 植物乳桿菌和含水量對120 d青貯辣木葉單寧含量的影響Table 6 Effect of moisture and LP treatment on the Tannin contents of silage M.oleifera leaves in 120 d(%DM)

2.3.3 植物乳桿菌和不同含水量對120 d青貯辣木葉營養(yǎng)價值的影響 由表7可知，60%含水量組相比于70%含水量組，TP含量顯著降低(P＜0.05)，F(xiàn)AA和NH3-N含量顯著升高(P＜0.05);70%含水量組添加LP后，TP含量有顯著降低(P＜0.05)，NPN含量顯著升高(P＜0.05);75%和70%含水量組添加LP后，NH3-N和FAA含量顯著升高(P＜0.05)。方差分析結果表明，水分對各個指標(CP除外)均有極顯著影響(P＜0.01);植物乳桿菌對NPN和TP含量有極顯著影響(P＜0.01)，對NH3-N和FAA含量有顯著影響(P＜0.05);二者的交互作用對TP含量有極顯著影響(P＜0.01)，對NPN含量有顯著影響(P＜0.05)。

3 討論

3.1 辣木葉作為青貯原料的特點

本試驗中使用的辣木葉原料CP為16.72%，低于劉昌芬等[24]報道的27.5%，這可能是不同的地理位置、品種、收獲時間導致辣木葉營養(yǎng)物質(zhì)含量不同。辣木葉原料NDF和ADF分別為31.24%和21.23%，均低于熱帶木本飼用灌木的平均含量[25](NDF:38.83%;ADF:33.67%);WSC為10.72%，張慶[26]報道，WSC是能否成功制作優(yōu)質(zhì)青貯飼料的關鍵，青貯原料中WSC一般需達到6%～7%以上，青貯飼料才能良好保存。本試驗中，辣木葉原料WSC為10.72%，這可能是辣木葉易于調(diào)制青貯飼料的原因。

3.2 含水量對青貯品質(zhì)的影響

青貯原料的含水量是影響飼料營養(yǎng)品質(zhì)和青貯發(fā)酵品質(zhì)的重要條件之一。本試驗中，辣木葉青貯發(fā)酵60和120 d時，與75%和60%含水量組相比，70%含水量組的NPN含量顯著降低，TP含量顯著升高;與60%含水量組相比，70%含水量組的FAA和NH3-N含量顯著升高。可見辣木葉青貯過程中，大量的蛋白質(zhì)降解成非蛋白氮。青貯飼料中蛋白質(zhì)的變化，除了與梭菌等有害菌的活動有關外，最主要的是植物中所含的蛋白質(zhì)水解酶的作用[27]，并且蛋白酶的活性受到p H的影響。在適宜含水量條件下青貯時，干物質(zhì)和可溶性碳水化合物含量較高，能夠增加發(fā)酵底物，快速降低p H得到較高的LA含量[28]，而原料含水量過高導致腐敗菌的滋生，同時產(chǎn)生的滲出液會使飼草養(yǎng)分流失較多[29]，含水量過低又會使介質(zhì)中水的活性降低，自身的產(chǎn)酸菌處于生理干旱狀態(tài)，酸度積累受到抑制，影響青貯的效果。因此NPN含量的降低，原因可能是酸性環(huán)境對蛋白酶活性的抑制作用以及適宜含水量減少腐敗菌的滋生。發(fā)酵60 d時，70%含水量組相比于60%含水量組，LAB和Yeasts的數(shù)目顯著升高，大腸桿菌數(shù)目小于2.0 log cfu·g-1FM，而LP，AA和PA含量均顯著降低，說明70%含水量組有利于乳酸菌等微生物的繁殖，這與張德玉等[30]研究結果一致。含水量低的青貯辣木葉的NDF和ADF含量整體高于含水量高的青貯，這可能是各水分組間青貯原料干物質(zhì)含量差異引起的。發(fā)酵60和120 d時，70%含水量組相比于60%含水量組，NH3-N和FAA含量顯著降低，同時NH3-N/TN(總氮)小于10%，說明70%水分條件下辣木葉青貯發(fā)酵中蛋白質(zhì)分解程度低，符合優(yōu)質(zhì)飼料標準[22]。

3.3 添加植物乳桿菌對青貯品質(zhì)的影響

在青貯過程中的乳酸菌數(shù)量需要達到1×105cfu·g-1才可以使p H迅速降低，抑制有害微生物的生長，減少青貯飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、分解和流失，同時減少胺等有毒物質(zhì)的產(chǎn)生，保證青貯料的質(zhì)量[32-33]。本試驗中，添加植物乳桿菌后，在辣木葉青貯發(fā)酵的60和120 d時，與CK組相比，70%含水量組TP含量顯著降低，NH3-N和FAA顯著升高。添加LP后，辣木葉青貯品質(zhì)雖有改善，但效果不太明顯，這可能是添加的乳酸菌與辣木葉原料中的乳酸菌產(chǎn)生了拮抗作用，這也導致了LP處理后70%含水量組中乳酸菌數(shù)量相比于CK組顯著降低，Wohlt[33]也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。另一方面，辣木葉中含有豐富的酚類化合物，具有抗菌活性[34-35]，這也可能是導致添加乳酸菌對辣木葉青貯發(fā)酵品質(zhì)改善效果不夠顯著的原因。與CK組相比，70%含水量組的有機酸(LA、AA和PA)含量顯著升高，原因可能是添加植物乳桿菌，使得PH迅速降低，抑制其他微生物的生長，有利于乳酸等有機酸的積累，這與玉柱等[36]，田瑞霞等[37]的研究結果一致。

3.4 添加植物乳桿菌和含水量對單寧含量的影響

單寧是植物性飼料原料中一種重要的抗營養(yǎng)因子，主要表現(xiàn)在減少動物采食量，降低營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用率及產(chǎn)生毒害作用[38-39]。同時，單寧對動物的生長具有多種生理活性，如止血、抑制微生物、抗過敏、抗突變、抗衰老等作用[40]。根據(jù)化學結構的不同，單寧通常分為水解單寧(棓酸酯類多酚)和縮合單寧(聚黃烷醇類多酚或原花色素)[41-42]。本試驗發(fā)現(xiàn):辣木葉直接青貯60和120 d后對單寧含量有一定的降低作用，這可能是因為青貯飼料中豐富的微生物產(chǎn)生了單寧酶[43]，單寧酶的活性受p H影響很大，劉如石等[43]和郭魯宏等[19]研究發(fā)現(xiàn)，單寧酶活性的最適p H為6.0～6.5。因此，可能是青貯過程的酸性內(nèi)環(huán)境影響了單寧酶的活性，導致單寧降解變化不顯著。

4 結論

辣木葉飼用價值較高且易于調(diào)制青貯飼料。青貯時適宜含水量和添加植物乳桿菌均可提高辣木葉發(fā)酵品質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)以70%含水量為最佳，顯著降低氨態(tài)氮(NH3-N)和氨基酸類游離氮(FAA)含量，顯著增加真蛋白質(zhì)(TP)和乳酸菌(LAB)含量;添加植物乳桿菌后，可以顯著增加有機酸(LA、AA和PA)的含量。研究還發(fā)現(xiàn)添加植物乳桿菌(LP)和調(diào)整不同含水量可以降低青貯辣木葉單寧含量，但影響不顯著。