二倍體菘藍開花習性及傳粉特性研究

張金霞，陳垣，2*，郭鳳霞*，王引權，周盛茂，肖生偉

(1.甘肅農業大學農學院，生命科學技術學院，甘肅省中藥材規范化生產技術創新重點實驗室，甘肅省藥用植物栽培育種工程研究中心，甘肅蘭州730070;2.甘肅省特色藥材規范化可追溯栽培工程技術研究中心，甘肅省特色藥用植物資源保護與利用工程實驗室，甘肅天士力中天藥業有限責任公司，甘肅 定西748100;3.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州730000;4.石家莊以嶺藥業股份有限公司，河北 石家莊050000;5.江蘇龍鳳堂中藥有限公司，江蘇 泰州225327)

菘藍(Isatis indigotica)為十字花科(Cruciferae)，菘藍屬(Isatis)二年生草本藥用植物[1]。藥材板藍根(Radix isatidis)為菘藍的干燥根，秋季采挖，除去泥沙，曬干，具有清熱解毒、涼血利咽等功效，用于瘟疫時毒，發熱咽痛，溫毒發斑，痄腮，爛喉丹痧，大頭瘟疫，丹毒，癰腫等癥。大青葉(Folium isatidis)為菘藍的干燥葉，夏秋二季分2～3次采收，除去雜質，曬干，具有清熱解毒，涼血消斑功效，用于溫度高熱、神昏、發斑發疹、痄腮、喉痹、丹毒、癰腫等癥[2]。板藍根還具有抗炎、解熱、提高免疫力和防治嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)[3]等流感病毒作用，臨床上被用于預防和治療咽炎、扁桃體炎、肝炎、角膜炎等感染性疾病[4]。隨著動物人畜共患病的傳播流行，板藍根和大青葉需求量隨之增加。然而，菘藍野生資源稀少，板藍根和大青葉藥源主要依賴栽培品。甘肅省河西地區民樂縣一帶是我國板藍根和大青葉的主要道地產區，2012年被農業部和中國特產之鄉推薦暨宣傳活動組委會授予“中國板藍根之鄉”。

種子播種栽培是菘藍生產的主要方式[5]。作為板藍根和大青葉的基原植物二倍體菘藍，在我國有著廣泛的栽培[6]，但由于長期以來采用種子繁殖而不加以選擇，加上種子商品流通，導致各地種植的品種混雜退化，造成藥材產量和品質參差不齊，以此原料炮制的大青葉和板藍根飲片及復方中成藥品的療效穩定性減弱。雖然部分產地已制定并實行菘藍規范化種植和加工管理，但這不能從根本上解決種源“質”的問題。中藥的品質是由遺傳特性及生長環境決定，其中遺傳因素是決定中藥材品質的內因，環境是外因，其影響程度與藥材種類有關[7]。植物的繁育是植物內在遺傳特性和外界環境相互作用的結果，是種群有性生殖的紐帶，對植物的遺傳變異和進化過程均有著重要的意義[8]。菘藍品種隨著種植年限的延長，混雜退化問題更為突出，嚴重影響藥材板藍根和大青葉的產量和內在品質[5]。王恩軍等[9]對民樂縣栽培菘藍研究發現，菘藍種質資源具有豐富的遺傳多樣性，主要農藝性狀變異豐富，變異系數(coefficient of variation，CV)為9.83%～69.82%，大青葉和板藍根產量的CV均大于50%。植物的花被特征和傳粉生物學是反映植物有性生殖能力的重要依據[10-13]。從植物開花習性入手，詳細研究其花部結構特征，傳粉媒介和傳粉者在花間的運動樣式、自交親和程度以及交配系統才能從根本上了解其繁殖特性[14]。有關藥用植物傳粉特性的研究廣泛而深入，陳垣等[15]研究探明了暗紫貝母(Fritillaria unibracteata)的花器官特征，郭鳳霞等[16]進一步研究探明了其傳粉生物學，這些研究奠定了川貝母基原植物新品種選育的理論基礎。盡管對菘藍有性繁殖特性的研究也有少量報道，葉青[5]研究了菘藍生物學特性，隨后高延輝等[6，17-18]研究發現菘藍花期自交不親和性較強，而蕾期自交親和性較高，并篩選了克服其自交不親和性的化學試劑。這些研究對了解菘藍生物學特性、自交不親和性及其利用均具有重要參考價值，但研究區與我國板藍根主要道地產區民樂縣地理及生態環境差異很大，自交不親和性的研究也僅是對吉林長春市生長2年的菘藍從人工自花授粉、天然套袋自交和人工去雄異交處理后，實驗室花粉培養萌發及柱頭顯微鏡檢判斷的結論，由于植物的傳粉特性不僅涉及自交不親和性，還包括傳粉媒介和結籽率等，并受基因型和外界環境因子的綜合影響，僅采用簡單處理后在實驗室培養條件下難以全面揭示其傳粉特性，去雄和不去雄花蕾在套網袋和紙袋條件下的結籽率和結實率均可反映其風媒和蟲媒傳粉的實證，也可揭示有無孤雌生殖現象，去雄后不套袋還可反映出自然異花授粉潛力，但目前有關這些研究尚未見報道，至今菘藍種子繁殖操作規程也未有頒布，生產上種子繁殖措施仍處于盲目階段。因此，在菘藍道地產區民樂縣自然環境條件下，采用多種處理系統研究菘藍開花習性和傳粉特性具有重要意義，可為菘藍新品種選育和種子標準化生產提供科學和技術依據，促進菘藍種質資源的可持續化發展。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗區位于甘肅省張掖市民樂縣，地處張掖市東南部，祁連山北麓，河西走廊中段，地勢南高北低，地形分山地和傾斜高平原兩大類，屬于溫帶大陸性荒漠草原氣候，海拔由北向南逐步從1589 m上升為5027 m，年均降水量351 mm，年均氣溫0～7.6℃，無霜期140 d。民樂縣地域遼闊，氣候冷涼，土壤肥沃，光照充足，適宜菘藍生長。當地生產的板藍根色白、粉性足、根條粗壯，總灰分含量低[19]，浸出物含量高，品質優良，被授予“中國板藍根之鄉”[19-21]。

1.2 菘藍播種栽培

2015年5月10日采用種子播種，種植于甘肅農業大學與民樂縣六壩鎮誠泰藥業有限公司板藍根科研基地高新農業示范園，試驗地地處100°43′28″E，38°38′36″N，海拔1824 m，種子播種量30 kg·hm-2，播種時在整好的畦面上按行距15 cm開挖3 cm的淺溝，將種子均勻地播入溝內，覆細土與畦面齊平，保持土壤濕潤，播種后第6天陸續出苗，出苗后間苗，留苗株距7 cm左右，田間管理同大田，2015年不采收大青葉和板藍根藥材，留株自然越冬繁殖種子。2016年越冬返青后從現蕾期開始田間觀察測定，并采用田間去雄、套袋及株間雜交等花朵處理及觀察統計，研究其開花習性和傳粉方式。

1.3 菘藍開花習性觀測

從2016年4月20日菘藍花蕾顯現開始，田間隨機選取大小、長勢相對一致，無病蟲害植株10株掛牌標記，田間記錄花序及小花在花序軸上的開放次序及持續時間，參照任明迅[13]的方法，選取具有代表性的10枚花蕾，觀察其發育動態。通過采集不同等級的花蕾在顯微鏡下觀察，根據花藥開裂程度和花粉成熟度的觀測結果確定花藥尚未成熟的花蕾標準，作為去雄和套袋處理的花蕾。

1.4 菘藍人工授粉處理研究

現蕾期在田間隨機選取大小、長勢相對一致的菘藍植株，根據上述花蕾標準在田間選擇發育一致的花蕾掛牌標記，參照郭鳳霞等[16]的方法采用套袋和不套袋，人工授粉和自然授粉等8個處理(表1)。選擇花萼微開縫，但花瓣未露出花萼的花蕾操作處理，此時柱頭已成熟，但花藥尚未成熟開裂。套紙袋后第7天摘除紙袋，套網袋不需要摘除網袋。每一花序選擇1～2朵發育良好的花蕾進行去雄操作，其余花蕾全部摘除，每處理重復操作20～60枚花蕾。去雄采用75%酒精消毒滅殺，防除雜花粉污染，去雄時若發現花蕾內有蟲或個別花藥開裂，則摘除棄用，重新選擇操作。選擇尼龍網(網孔1 mm×1 mm)材料制作網袋(大小6 cm×4 cm)，以嚴防昆蟲傳粉。選擇防水透光的硫酸紙制作紙袋(大小6 cm×4 cm)嚴防風媒傳粉。去雄時保留部分花瓣，待花瓣微露出花萼后授粉，此時柱頭活力較強，并可避免蕾期自交的可能，授粉后重新套袋。田間套袋時將袋從花序頂端套入，用回形針夾住，使袋隆起有一定空間，以免束縛花朵生長發育，造成花朵脫落。種子成熟時，收集統計各處理短角果數和種子數，最后計算結籽率和結實率，并根據自交結種子數和結籽短角果數計算自交親和指數(self-compatibility in-dex，SCI)和自交不親和指數(self-incompatibility index，SII)平均值[22]。采用王曉佳等[22]的自交親和指數或自交不親和指數標準判斷菘藍自交不親和性，即，以0.5＜SII≤1或0≤SCI＜0.5為強自交不親和性。采用郭鳳霞等[16]和任躍英[27]的異交率(outcrossing rate，OCR)判斷傳粉方式，OCR＜5%為自花授粉，OCR＞50%為異花授粉，5%＜OCR＜50% 為常異花授粉。

結籽率(seed set rate)=結種子數/總花數×100%

結實率(fruit rate)=結籽短角果總數/短角果總數×100%

SCI=套紙袋自交結籽數/套紙袋總花蕾數(去雄同株異花人工授粉結籽數/去雄同株異花人工授粉總花蕾數)

SII=1-不去雄套紙袋自交結籽數/不去雄套紙袋總花蕾數(1-套紙袋自交結籽數/套紙袋自交總花蕾數)

表1 菘藍花器不同處理及其檢測目的Table 1 Different treatments of floral organ and their detecting aims for I.indigotica

1.5 菘藍傳粉媒介觀察

從花蕾顯現至開花結束，在菘藍試驗田對傳粉媒介觀察，從昆蟲訪花活動情況和花器操作傳粉結實統計結果綜合判定其傳粉媒介。

1.6 數據分析

采用Excel 2007統計軟件繪圖，圖中數據點為平均值±標準誤(mean±SE)。對于不同授粉處理的種子數、結籽率等性狀指標的差異性采用單因素方差分析，多重比較選用Duncan法。

2 結果與分析

2.1 菘藍開花習性

田間觀察發現，民樂縣栽培二倍體菘藍屬二年生草本藥用植物。2015年采用種子播種，2016年越冬返青后4月20日植株頂部陸續抽薹現蕾，28日后花蕾陸續開放，圓錐復總狀花序，生于枝頂(圖1A，B)。開花后，單株花序起初緊蹙在一起，花序軸在開花的同時逐漸伸長，花序自上而下依次開放，首先主莖頂端的花序軸伸長，頂端花序軸基部小花最先開放，靠近頂枝的下一級花序軸小花隨后開放，單花序軸從花序的基部自下而上依次開放，主莖頂部不斷生出花序，花序頂部不斷生出小花蕾，最后整個植株變得大而疏松，形如錐形，屬于無限開花習性(圖2A，B)。初現花蕾綠色，發育過程中鮮黃色花瓣逐漸從花萼間隙顯現伸長并展開。花朵開放與花藥開裂均與氣候環境條件有關，當遇氣溫較低或陰雨天氣時，其開花延遲，甚至不開放。無風晴朗天氣條件下，開花花朵花瓣向外張開角度大，白天開花主要集中在上午8:00-12:00。遇暴風天氣花瓣縮成半閉合狀態。長雄蕊花藥一般在開花20 min后花藥開始開裂，短雄蕊延后1～2 h才開裂，花粉成熟時，柱頭與花藥平齊，隨后柱頭高度略低于長雄蕊花藥，略高于短雄蕊花藥，隨著花的開放，花絲拉伸至最長。開花盛期，單株每天集中同時開放15～40朵，每花序開放3～8朵。單株開花數、花蕾比和花朵開放率在單株間變異幅度較大，變異系數均達100%以上，花蕾比低于30%(表2)。

菘藍主莖頂部著生花序和第一花序軸著生花數均最多，沿主莖向下依次減少，頂端花序軸著生花數60～150朵，倒一級花序軸著生花數45～140朵，倒二級花序軸著生花數20～100朵。初開花瓣呈十字180°左右展開，雄蕊圍繞柱頭60°左右展開(圖2C～F)，單花壽命6～7 d，異常氣候可縮短至3～4 d，群體開花期30 d左右。雄蕊6枚，4長2短，淡黃色，背著藥，縱裂且面向雌蕊開裂，開放花朵的長、短雄蕊花絲長度相差約1.00 mm左右;子房上位近圓柱形，柱頭平截，綠色，雌蕊長2.30～2.62 mm(圖2G，H)。

圖1 菘藍開花期植株形態及花被特征Fig.1 The flower shape and perianth characteristic of I.indigotica during blooming

圖2 菘藍花序特征及開花習性Fig.2 The inflorescence characteristic and flowering habit of I.indigotica

2.2 菘藍傳粉結實特性

表3顯示，不同花器操作處理對菘藍結籽率和結實率均具有極顯著影響(P＜0.01)。在自然條件下，菘藍授粉結籽率和結實率均最高，分別為95.00%和100.00%，不去雄套紙袋不結種子，不去雄套網袋結籽率較套紙袋提高5.0%，結實率提高6.7%，說明風媒也有微弱傳粉作用。去雄套網袋較不去雄套網袋結籽率提高8.7%，結實率提高7.6%，進一步說明菘藍存在風媒傳粉概率。去雄套紙袋不結短角果和種子，說明菘藍不存在無融合生殖或孤雌生殖現象(parthenogenesis)。不去雄自然條件下，菘藍開花前套紙袋不結種子，結籽率和結實率均為0，揭示菘藍存在較強的自交不親和性。去雄套紙袋同株異花授粉結籽率和結實率均約4.0%，去雄套紙袋異株異花授粉結籽率較自然授粉顯著降低(P＜0.05)，結實率兩者間的差異性不顯著(P＞0.05)，但較同株異花結籽率提高68.0%(P＜0.01)，結實率提高93.0%以上(P＜0.01)，而去雄不套袋自然傳粉條件下結籽率和結實率均在53.3%以上(表3)，說明菘藍自花傳粉力極弱，同株異花結籽率很低，顯示出高度的自交不親和性，株間異交親和性更強，屬異花授粉，需傳粉者，昆蟲為主要傳粉媒介，風媒也可輔助傳粉。

表2 2016年4月28日民樂縣菘藍開花期田間單株開花統計Table 2 Blooming statistics of single plant on April 28,2016 in I.indigotica field in Minle county

表3 花器操作對菘藍田間結實特性的影響Table 3 Effect of floral organ operations on seed set traits for I.indigotica

圖3顯示，菘藍自交不親和指數變幅為0.96～1.00，親和指數變幅為0.00～0.04，自然自交親和指數為0，人工去雄自交親和指數0.04，平均自交親和指數(SCI)極顯著小于0.5(P＜0.01)。菘藍自然自交不親和指數為1，人工自交不親和指數0.96，平均自交不親和指數(SII)接近1，極顯著大于0.5(P＜0.01)，按照王曉佳等[22]的標準判斷，屬于典型的自交不親和性植物。

圖3 菘藍自交親和指數與自交不親和指數比較Fig.3 Comparison of self-compatibility index and self-incompatibility index for I.indigotica

2.3 菘藍傳粉媒介觀察

田間觀察發現，菘藍在花蕾期訪花昆蟲數量多，活動頻繁，在花序間穿梭，這些昆蟲在菘藍植株上往返訪花采食花粉(圖4)，在植株花序上訪花停留時間隨植株和花序的不同而異。初步鑒定訪花昆蟲主要是食蚜蠅(Scaeva pyrastri)(圖4A，B)、黑蜂(Apis mellifer)(圖4C)。這些昆蟲的胸、腹、足等部位置顯微鏡下抖落觀察均粘有大量的花粉粒。田間試驗條件下，當微風吹過時，開放花朵的花冠中散落大量花粉粒，但遇大風天氣時，花瓣幾乎處于閉合狀態，不利于風力向外散布花粉，說明昆蟲是菘藍實現有性繁殖的主要傳粉媒介，風媒只起到輔助傳粉的媒介作用。

圖4 菘藍花朵間傳粉昆蟲活動情況Fig.4 Activity conditions of pollination insects among I.indigotica flowers

3 討論

3.1 菘藍株內具有異向無限開花習性，以蟲媒傳粉為主

植物繁育系統是指能夠代表直接影響其后代遺傳組成的所有有性特征[23]，主要包括植物花部特征、花器官壽命、花開放式樣、自交親和程度和交配系統[24]。野生藥用植物高烏頭(Aconitum sinomontanum)主莖自下而上依次遞進開花[25]。開花習性也是物種長期適應環境的一種保護策略。本研究發現，二倍體菘藍生長第2年植株較大、群體開花期持續30 d，花小而密集，單株內花序與同一花序軸上花朵開放次序異向，花序從株頂自上而下，而單花序內自下而上依次開放，形成明顯反向開放次序，這種無限開花習性有利于吸引昆蟲，同時也可降低鳥類啄食，頂部花蕾可阻擋強光和大風，在一定程度上保護開放花朵。初現綠色花蕾花藥尚未成熟開裂，說明閉花授粉受限。花瓣微露出花萼后開花當天，花粉量最多，雄蕊的長短不齊也反映出占據空間位置的效能。花瓣，雄蕊和花絲均呈鮮黃色，由于黃色能吸收紫外光，可避免花器受到強紫外傷害，黃色也可扮演花粉和花粉囊色，吸引昆蟲，提高傳粉效率，顯花植物為了吸引傳粉昆蟲而排斥食花害蟲訪花的決定，利用花特有的顏色和氣味行使信號功能[16]，貝母屬植物黃花(Fritillaria koidzuminia)可吸引蜜蜂和蠅類等傳粉者[26]，這也反映出菘藍蟲媒傳粉的實事。田間觀察也發現，菘藍盛花期，有許多蜂類、蠅類等昆蟲訪花，白天隨氣溫升高數量增多，從上午10:00至12:00和下午2:00至3:00，訪花者數量出現峰值，田間訪花活動最為頻繁的昆蟲主要是食蚜蠅和黑蜂，訪花者在某一株上采食花粉后，身體絨毛粘有大量花粉，又飛往另一株采食，大多數采食花朵花瓣微開，花粉鮮黃，進一步印證了昆蟲傳粉的現實。但是并不能排除風媒傳粉的可能，因為鮮黃的花粉多而散，隨風散落花器四周，這一結果進一步證明菘藍傳粉媒介以蟲媒為主，風媒為輔。

3.2 菘藍屬異花授粉類型，并具有較強的自交不親和性

植物傳粉受精過程與種子的形成和質量具有重要的關系，是高等植物傳宗接代過程中最主要的環節，在植物繁殖、遺傳、變異、進化等方面具有重要的作用[23-24]。在自然界中植物開花后成熟花粉在傳粉媒介作用下從雄蕊花藥或小包子囊中散出后傳送到雌蕊柱頭或胚珠上的過程稱為傳粉，傳粉媒介主要有蜜蜂、甲蟲、蠅類等和風，此外蝙蝠、蝸牛也能傳粉，有些植物還通過水進行傳粉[23]。藥用植物育種中，根據花部結構、開花習性和傳粉特性等方面分為3種類型:異交率＜5%為自花授粉，異交率＞50%為異花授粉，異交率介于5%～50% 為常異花授粉[16，27]。測定植物親和指數一般在花期采取密網阻隔飛行昆蟲、用化學藥劑阻隔爬行類昆蟲、套袋隔離和增大株距等措施，結籽還受植株營養狀況、花粉活力、柱頭可授性、花枝部位和氣候(光照、溫度和水分)等生育差異帶來的影響[27]。菘藍是十字花科藥用植物，解決菘藍制種的技術問題是雜種優勢利用的關鍵。本研究2016年在民樂縣大田采用兩年生的菘藍進行套袋隔離花器操作處理方法，為了減少誤差，通過在授粉前對花粉活力和柱頭可授性預檢測，選擇花枝部位分枝和花期一致的花蕾，研究結果發現在4月中旬菘藍現蕾開始柱頭已具有可授性，但花藥未開裂，不能閉花授粉，此期去雄套紙袋處理不結實，說明本研究選蕾恰當，也說明菘藍不存在無融合生殖現象，這與胡春等[28]對青藏高原優勢毒雜草鈍裂銀蓮花(Anemone obtusiloba)研究的結論相反，反映出毒草自繁能力更強，因為郭鳳霞等[16]研究也發現，瀕危珍稀藥用植物暗紫貝母不存在無融合生殖現象。本研究還揭示，菘藍自然授粉結籽率為95.0%，去雄套紙袋異株異花人工授粉結籽率72.0%，去雄不套袋結籽率53.3%，不去雄套網袋結籽率5.0%，去雄后套網袋提高至13.7%，說明菘藍屬于典型異花授粉類型，去雄套紙袋異花人工授粉低于自然授粉，可能是由于菘藍花朵小，紙袋隔絕風媒傳粉概率，也可能是套紙袋對雌蕊還有遮陰擾動對去雄后花器受損的補償效應在一定程度上損耗了雌蕊營養。套網袋條件下，去雄結籽率較不去雄后提高8.7%，說明雄蕊還具有一定的傳粉物理隔離作用。菘藍不去雄和去雄套紙袋均不結實，去雄套紙袋人工同株異花授粉結籽率和結實率僅4%左右，既反映出菘藍風媒傳粉的可能，也反映出菘藍較強的自交不親和性，這與高延輝等[6，17]對吉林長春市二年生菘藍顯微鏡檢得出的結論相一致，即菘藍在花期套袋天然授粉的自交親和指數為0.078，花期人工授粉的自交親和指數為0.110，不同的是本研究在民樂縣自然氣候條件下套袋天然授粉的自交親和指數為0，花期人工授粉的自交親和指數僅0.040，揭示菘藍在該區自然氣候條件下自交不親和性表現更強，這種特性可能是適宜環境條件下菘藍回避自交退化的一種本能的應激反應，因為高寒區瀕危藥用植物暗紫貝母具有弱的自交親和性，通過部分自交親和提高極端環境條件下花粉傳遞效率，才使得稀有物種得以繁衍生息[16]，但民樂縣屬于河西走廊地區，光、溫和水資源豐富，長期溫濕度適宜的生態壓力下不利于菘藍自花傳粉行為的完成，而有助于株間花粉競爭傳粉行為的驅動。

4 結論

菘藍株內具有異向無限開花習性，不存在無融合生殖，具有較強的自交不親和性，異花傳粉效率高，訪花者主要有蜂類、蠅類等，具有培育優良自交不親和系進行雜種優勢利用的巨大潛力，甘肅省河西走廊地區民樂縣一帶是菘藍制種的優勢生態區，對菘藍傳粉蜜蜂種類及訪花頻率的研究、菘藍自交不親和系的選育和雜交種的配置將是下一步研究的重點，菘藍開花期長，可在開發菘藍花蜂蜜產業中引起關注，以期促進菘藍的產業化健康發展。

致謝:甘肅省民樂縣誠泰藥業有限公司韓大雷提供試驗地和幫助，成都天地網信息科技有限公司的張斌參與田間管理。本科生張藎鳳、徐博瓊、王柏林、王雪琴、張旭鵬、周艷參與試驗指標測定，在此一并致謝。