螺內酯對代謝綜合征大鼠心肌重構的干預作用＊

張小云，張旭升，黃戰軍，樊小容，譚小青，蔡博治

代謝綜合征（metablicsyndrome，MS）包括糖耐量減低、中心性肥胖、脂代謝紊亂、高尿酸血癥、高血壓及心腦血管疾病。大量研究證實，MS可引起血管內皮功能障礙、動脈粥樣硬化及心肌纖維化等疾病的發生發展，最終導致心血管重構［1，2］。MS 誘導的心肌重構過程非常復雜，研究發現其與高血脂、胰島素抵抗及高血壓等相關，分子機制包括炎癥反應、血管活性肽及脂肪細胞因子等作用相關。而醛固酮［2］（ALD）是體內具有促體內多種器官組織纖維化的活性因子，尤其與心血管重構的關系密切，主要與鹽皮質激素受體結合發揮各種生物學效應，但是否參與MS誘導的心肌重構目前尚不清楚。為此，該研究通過建立MS模型鼠誘導心肌重構，并觀察該過程中ALD及其受體的表達和變化；采用醛固酮受體阻滯劑螺內酯干預，觀察其對心肌重構的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品、儀器及動物雄性SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。高果糖飼料購自北京華阜康生物科技有限公司；醛固酮放射免疫試劑盒購自北京華英生物研究所；鹽皮質激素受體一抗購自北京博奧森生物技術有限公司，二抗及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；其余為進口或國產分析純試劑。血糖試紙及快速血糖儀購自美國雅培；鼠尾動脈無創測壓儀由汕頭大學醫學院動物實驗中心提供；Beckman Coulter AU5800由汕頭大學醫學院第一附屬醫院檢驗科提供。

1.2 MS動物模型制備取雄性SD大鼠8只作為正常對照組，普通飼料喂養；取雄性SD大鼠16只作為MS組，用高果糖飼料喂養10周，檢測尾動脈壓、血糖和血脂水平，以確定MS模型建立成功。將造模成功的MS大鼠隨機分成MS組（8只）和MS+螺內酯組（8只），均繼續高果糖喂養，MS+螺內酯組每天予螺內酯40 mg/kg·d灌胃1次。4周后稱重，3%水合氯醛麻醉，從心臟取血，將部分血液置入含有EDTA的試管中，4℃離心分離血漿，-80℃冰箱保存。迅速分離出心肌標本，切取部分心肌組織，用冰生理鹽水洗凈殘余血液，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋用于染色，其余錫紙包裹，-80℃冰箱保存。

1.3 血壓、血糖和三酰甘油的測定采用鼠尾動脈測壓儀測量血壓；禁食8 h后尾動脈取血，快速血糖儀檢測血糖，并迅速用離心機分離出血清，使用Beckman Coulter AU5800生化儀檢測血清三酰甘油水平。

1.4 心肌組織膠原Masson染色取大鼠心肌組織，用4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，制作4 μm厚連續切片，常規脫蠟、水化、脫水，進行Masson染色。在光鏡下觀察、照相，進行圖像學分析。

1.5 血漿和心肌ALD含量的測定將血漿和心肌組織標本用干冰保存，送北京華英生物研究所，采用放射免疫法測定血漿和心肌組織中ALD含量，具體步驟按試劑盒說明書操作。

1.6 免疫組織化學檢測心肌組織鹽皮質激素受體的表達取心肌組織制備組織切片，石蠟包塊，制作4 μm厚連續切片，常規脫蠟入水，抗原修復，封閉非特異性抗原，滴加鹽皮質激素受體一抗過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化、脫水、透明、中性樹膠封片，具體步驟按說明書進行。

1.7 統計學方法采用Graph pad prism4統計軟件進行數據處理及統計學分析。計量資料用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析法，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠MS模型特征使用高果糖飼料喂養大鼠10周后，其平均動脈壓、血糖、三酰甘油水平明顯高于正常對照組，提示建模成功，見表1。

表1 兩組間平均動脈壓、血糖、血脂比較（±s）

表1 兩組間平均動脈壓、血糖、血脂比較（±s）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.01。

三酰甘油（mmol/L）正常對照組 8 102.65±7.25 0.85±0.55 2.22±0.55 MS 組 16 128.85±6.85＊ 2.68±0.61＊ 6.78±0.67＊組別 n 平均動脈壓（mmHg）血糖（mmol/L）

2.2 大鼠心肌組織Masson染色采用Masson染色觀察大鼠心肌組織，與正常對照組比較，發現MS大鼠心肌組織有明顯膠原沉積，心肌細胞排列紊亂。用螺內酯干預后，心肌膠原沉積有所改善。見圖1。

圖1見封三。

2.3 大鼠血漿和心肌組織ALD含量的變化MS組心肌組織ALD表達明顯增加，采用螺內酯干預后，ALD表達明顯下調；3組血漿醛固酮水平無統計學差異。見表2。

表2 血漿和心肌組織醛固酮含量比較（±s）

表2 血漿和心肌組織醛固酮含量比較（±s）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.01；與 MS 組比較，#P＜0.01。

組別 n 心肌組織ALD（ng/g蛋白）血漿ALD（ng/L）正常對照組 8 8.25±1.55 86.45±5.55 MS 組 8 27.65±3.55＊ 91.47±5.85 MS+螺內酯組 8 18.55±6.23＊# 90.55±5.25

2.4 大鼠心肌組織鹽皮質受體表達的變化與正常組相比，MS組心肌組織鹽皮質激素受體表達明顯上調，用螺內酯干預后，心肌組織鹽皮質激素受體表達有所下調。見圖2。

圖2見封三。

3 討論

MS與許多心血管疾病的發生和發展密切相關，是目前心血管領域研究的熱點。大量研究發現MS大鼠模型可出現心肌重構，表現在心肌細胞排列紊亂，膠原蛋白沉積明顯。其分子機制可能與炎癥反應、部分血管活性肽如尾加壓素Ⅱ及脂肪細胞因子作用等相關［2-4］。因此，探索參與MS心肌重構的因子，對于揭示心肌重構機制并為其防治提供新的臨床策略具有重要意義。

ALD是腎素-血管腎張素-醛固酮系統（RASS）的終末激素，也是體內重要的鹽皮質類固醇激素，ALD主要通過經典的血管緊張素轉換酶途徑和心血管等組織自分泌/旁分泌的方式產生。其中心血管組織的ALD合成不受血漿ALD水平的影響，可以單獨作用于血管壁、心肌組織，可引起局部組織炎癥反應、纖維化、膠原蛋白及鈣鹽的沉積等，因此ALD 在心血管重塑過程中起著重要的作用［2，5-7］。 該實驗結果表明，采用高果糖飼料喂養大鼠后，其血壓、血糖及三酰甘油明顯高于正常對照組，成功建立MS大鼠動物模型。采用Masson染色，觀察到心肌組織全程均有膠原蛋白明顯沉積，心肌細胞排列紊亂，提示心肌重構。與此同時，心肌組織ALD含量與其相應受體表達明顯增加，誘導局部組織炎癥反應、膠原沉積等生物學效應，進一步加重心肌重構的進展。因此，采用ALD特異受體拮抗劑螺內酯干預，可逆轉心肌重構這一病理過程。而三組大鼠血漿ALD水平無明顯差異，這提示醛固酮/鹽皮質激素受體系統可能參與了MS大鼠心肌重構的過程，并且是通過自分泌/旁分泌的方式起作用的。

實驗證實ALD能通過氧化應激等機制，誘導心血管組織周圍炎癥反應，如細胞黏附分子-1、單核細胞趨化蛋白-1和腫瘤壞死因子α等炎癥因子的表達增加，導致血管、心肌局部組織纖維化的發生發展，而選擇性ALD受體拮抗劑能降低炎癥因子的表達，延緩心肌和血管的損傷。外源性醛固酮還可誘導心肌成纖維細胞增殖，促進膠原蛋白合成［6，7］，而細胞增殖和細胞間質膠原蛋白的沉積是心血管纖維化過程中重要的病理條件。所以，ALD與心血管重構事件的發生密切相關，該課題組亦在動物血管鈣化模型中證實ALD可促進大鼠血管鈣化及纖維化的進程［8，9］，涉及的分子機制與炎癥反應等相關。綜上所述，在病理狀態下，局部組織ALD水平表達增加（旁分泌、自分泌的方式），通過結合鹽皮質激素受體，激活相關分子途徑如誘導炎癥反應、氧化應激等作用，通過Rho激酶等信號轉導通路［10，11］，刺激心肌細胞增殖、膠原沉積等，促進心肌重構的發生和發展。

ALD曾被認為主要起調節體內鈉鉀離子平衡的作用，隨著研究不斷深入，它不僅是體內重要的促纖維化物質，還是重要的促炎癥因子。該實驗發現MS大鼠心肌重構，心肌組織醛固酮/鹽皮質激素受體的表達明顯增加，提示醛固酮/鹽皮質激素受體系統參與了心肌重構的過程，用螺內酯干預可明顯逆轉該過程，為心肌重構的機制奠定理論基礎，并為防治提供新的臨床思路，其內在的信號轉導通路尚需進一步研究證實。