血液透析系統內毒素檢測及其濃度含量控制*

王蘇湘 滕朝宇 吳 瑕 王 宇

據中國醫院管理協會2008年年底統計，我國大陸地區共有102863例慢性透析患者，患病率為79.1/100萬人口，年患病率為52.9%，其中有89.5%的患者接受血液透析治療[1]。2017年8月4日第九屆中國血液凈化論壇報告表明，目前我國慢性腎臟病患者超過1.2億，其中3期以上約1800萬(占0.13%)。原國家衛計委“鼓勵獨立的血透中心開展血液透析治療”的文件發布以來，開展血液透析治療的機構快速增加，保障治療安全等工作迫在眉睫。

開展血透治療時，透析液的配制、透析機的沖洗、透析器及血路管道用水都要求使用無菌的去離子反滲透(reverse osmosis，RO)水，即透析用水。傳統透析治療需要水120～180 L，高通量透析會消耗更多的水，而透析用水的水質直接關系到透析的遠期效果[2]。為避免不合格水質對患者的不良反應，透析用水必須嚴格進行質量控制。否則，一旦細菌或化學性物質進入人體會引起并發癥，透析用水的衛生質量關系到眾多腎功能衰竭患者的身體健康和生存質量。因此，微生物及內毒素污染的防控、規范透析用水、透析濃縮液和透析液的質量十分重要。

1 內毒素與血液凈化

內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁結構中的類脂多糖體(脂多糖)，在細菌死亡后裂解釋放出來。內毒素能與血管壁細胞膜結合，改變血管通透性，使血壓下降導致休克。內毒素水解后可以穿過透析膜進入到患者的體內，導致急性熱源性反應，使患者產生低血壓、肌肉痙攣、頭痛及發熱等癥狀，嚴重的可導致休克或內毒素血癥[3]。

1.1 內毒素與鱟試劑法

鱟試劑法是目前測定內毒素的主要方法，該方法檢測內毒素特異性強、靈敏度高且操作方法簡便，美國藥典(USP)和中國藥典(CP)均已收載[4]。檢測方法有凝膠法和光度測定法，光度測定法又包括濁度法和顯色基質法。鱟試劑中的C因子能夠與內毒素反應，激活B因子，活化后的B因子使凝固酶原變成凝固酶，凝固蛋白原在凝固酶的作用下形成凝固蛋白，最終形成凝膠。

1.2 內毒素污染來源

與透析有關的內毒素污染來源[5]主要包括以下4個方面。

(1)水前處理系統。透析用水的處理系統包括沉淀過濾器、軟水器、活性碳過濾器等水質前處理系統，以及逆滲透膜系統或去離子器和超過濾器等。

(2)反滲水輸送管道。管徑大小、材質和結構的不同會造成細菌滋生，甚至會形成生物膜附著在管路的表面而有利細菌的滋生，污染復用用水。

(3)透析濃縮液配制的過程環節，透析濃縮液的污染，重碳酸鹽透析液非常容易滋長細菌。

(4)透析機的污染，上下機及兩班連臺之間的消毒控制。

1.3 內毒素超標的臨床表現

血液透析設備系統消毒過程中透析用水、透析濃縮液及透析液內毒素超標會將內毒素帶入尿毒癥患者血液，導致尿毒癥患者產生內毒素血癥。內毒素作用于吞噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞、血小板、補體系統以及凝血系統，并誘生腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-a)、白細胞介素-1(interleukin，IL-1)、IL-6和IL-8、組胺以及激肽等生物活性物質，使組織器官毛細血管灌注不足，出現缺氧及酸中毒等。高濃度的內毒素也可激活補體替代途經，引發高熱、低血壓以及活化凝血系統，最后導致彌散性血管內凝血。嚴重時可導致微循環衰竭和低血壓為特征的內毒素休克甚至死亡。發現后要檢查原因，感染者應給予抗感染治療[6-7]。

2 研究材料與方法

應用戴明循環(plan do check action，PDCA)動態循環方法管理血液透析內毒素濃度含量控制過程，制定有效管控計劃，嚴格執行，對出現的問題應具備解決方案和處理措施；并形成記錄，實現菌毒共控、醫療安全的目的[8-9]。

2.1 檢測樣本及樣品收集

(1)采集2014年1月至2017年8月常德職業技術學院附屬第一醫院血液凈化中心的透析用水、透析濃縮液及透析液檢測樣本。

(2)將透析濃縮液連接至血液透析機，機器進入自檢狀態。待血液透析機的自檢程序結束以后，安裝一次性透析器和透析管路，將透析液快速接頭按照要求連接到透析器，透析液由下向上進入透析器；關閉透析液，取下透析器透析液入口的快速接頭。將快速接頭開口向上，打開透析液開關后透析液自然流出。將取樣吸管或注射器插到快速接頭底部取樣，注意吸頭不可碰到快速接頭密封圈外側。透析用水及透析濃縮液采樣，用絡合碘擦拭控制閥出液口，沖洗干凈后再提取供試樣本。

2.2 儀器與試劑

采用ELx808IULALXH型鱟試驗微生物快速檢測儀(美國威諾斯基Bio-Tek公司)；渦旋振蕩儀(江蘇康健醫療用品有限公司)；恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備公司)。透析專用鱟試劑檢測試劑盒(0.25 EU/ml，Lot No 130725，Lot No 140825)、透析專用鱟試劑檢測試劑盒(0.5 EU/ml，Lot No 120916，Lot No 140705)、透析專用鱟試劑檢測試劑盒(2 EU/ml，Lot No 130620，Lot No 140825，Lot No 151201)和動態濁度法鱟試劑盒(Lot No 180627B)均來源于廈門鱟試劑生物科技股份有限公司。細菌內毒素工作標準品，無熱原吸頭，細菌內毒素檢查用水，無熱原板條，無熱原接收管。

2.3 透析相關細菌內毒素限值

(1)根據國家醫藥行業標準《血液透析及治療相關用水》(YY 0572-2015):透析用水的內毒素含量應≤0.25 EU/ml[10]。美國醫療儀器促進協會(The Association for the Advancement of Medical Instrumentation，AAMI)采用2EU/ml的水平作為內毒素的上限值[11]。歐洲藥品質量管理局(European Directorate for the Quality of Medicines &HealthCare，EDQM)規定0.25 EU/ml為內毒素的上限值。國際標準化組織(ISO)在ISO13959:2009標準2008年的修訂過程中，0.25 EU/ml的限值被列入作為透析用水內毒素的上限值。

(2)根據國家醫藥行業標準《血液透析及相關治療用濃縮物》(YY 0598-2015):濃縮物以細菌內毒素用水配制成透析液后，透析濃縮液的內毒素限量應＜0.5 EU/ml[12]。

(3)根據原國家衛生和計劃生育委員會2010版《血液凈化標準操作規程》，透析液內毒素限量＜2 EU/ml[13]。

2.4 凝膠法檢測內毒素(透析專用鱟試劑)

(1)陰性對照溶液的制備。即細菌內毒素檢查用水(TAL reagent water，TRW)。

(2)陽性對照溶液的制備。濃度為2λ的內毒素溶液(λ為鱟試劑的標示靈敏度)。

(3)樣本溶液的制備。用無熱原采樣瓶收集適量的透析用水或透析液。按鱟試劑的靈敏度(λ)及樣本的內毒素限值(L)計算樣品的最大有效稀釋倍數(maximum allowable dilution，MVD)，其計算為公式1:

(4)樣本陽性對照溶液的制備。含2λ內毒素的樣本溶液或稀釋后樣本溶液。

(5)實驗操作。從試劑盒內取出8支鱟試劑，開啟，設置檢查項目及加樣見表1。

表1 設置檢查項目及加樣(ml/管)

加樣完畢，封閉管口，輕輕搖勻混合液，放入37 ℃的恒溫水浴鍋溫育60 min，溫育期間避免振動。

(6)結果判斷。將安瓿從恒溫水浴鍋中輕輕取出，緩慢倒轉180°。若安瓿內的內容物呈堅實凝膠，不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為(+)；不呈凝膠或雖生成凝膠但不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為(-)。

(7)當陰性對照管結果均為陰性，陽性對照管和樣品陽性對照管為陽性，實驗有效，否則無效，應重復實驗。

2.5 動態濁度法檢測內毒素

(1)程序設置。①儀器預熱，設置孵育溫度為37 ℃；②振板設定為中速，振板5 s；③動力學參數設定，讀板120 min，讀板間隔30 s，檢測波長為630 nm。

國際關系史的經驗證明，文化差異是影響國家間深入合作的隱形溝壑，是導致國家間信任缺失的重要因素之一。“文化間良性的交流與合作可以增進各國間友好關系的發展”，“不同文化間的良性互動關系不僅有利于文化發展，而且有利于國家間關系趨穩、趨善。”[5]因此，加強中國與中亞國家之間的互信與合作，必須要跨越文化差異的障礙。文化的傳播、交流與互動是促成文化間開展對話、達成文化和解與包容的重要途徑。

(2)標準曲線制備。將細菌內毒素工作標準品制備成5個濃度的稀釋液，相鄰濃度間稀釋倍數≤10倍，最低濃度不低于所用鱟試劑的標準檢測限。取細菌內毒素工作標準品1支，加入1.0 ml細菌內毒素檢查用水，渦旋振蕩15 min，將其稀釋配制成0.005 EU/ml、0.01 EU/ml、0.1 EU/ml、1 EU/ml和10 EU/ml的5種濃度的反應溶液，陰性對照為細菌內毒素檢查用水。每個濃度點測3個平行，陰性對照測兩個平行。

(3)標準曲線及樣品檢測。取每個濃度點的內毒素溶液各0.1 ml或樣品0.1 ml與0.1 ml鱟試劑反應。鱟試劑的準備:用移液器準確吸取細菌內毒素檢查用水1.7 ml，沿瓶壁加入西林瓶內，輕輕轉動瓶壁，使內容物全部溶解(避免產生氣泡)。

(4)數據處理。設定啟動OD(一般設定為0.02)，軟件自動給出啟動時間。建立標準曲線為公式2:

式中y為啟動時間的對數值，x為內毒素濃度的對數值，a為直線斜率，b為y軸截距。

當陰性對照的反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間，標準曲線的相關系數｜r｜≥0.980，標準曲線成立。

3 結果

3.1 透析專用鱟試劑(凝膠法)檢測

2014-2017年采用3種規格透析專用內毒素凝膠法檢測試劑盒檢測結果見表2。

表2 透析用水、透析濃縮液及透析液內毒素檢測結果

3.2 動態濁度法檢測

內毒素濃度標準曲線中Y=-0.2593X+2.938 r=0.997，見圖1。

圖1 內毒素濃度標準曲線圖

表3 供試液樣品的內毒素濃度檢測值

采用定量檢測法—動態濁度法檢測試劑盒結合專業設備Elx808IULALXH檢測反滲水、透析液、置換液以及反滲水出(回)水口的內毒素濃度值見表3。

表3結果表明，出口反滲水和反滲水回水口的內毒素值偏高，應立即進行消毒。

4 討論

臨床透析單位內毒素檢測普遍采用凝膠法，雖然此法操作簡單，結果一目了然。但也存在一些不足:①無法掌控合格值下的趨勢變化，試劑精密度較差，靈敏度誤差為0.5～2；②凝膠法鱟試劑根據凝膠的形成情況，用肉眼判斷陰陽性，容易造成假陽性、假陰性的判斷結果，對技術水平要求高。

臨床上有時需要對內毒素的濃度進行實時監測，凝膠法無法精準定量，應當選擇動態濁度法。近年來，大中型透析中心逐漸開始應用定量分析方法檢測透析用水、透析濃縮液和透析液的內毒素濃度。動態濁度法與凝膠法的反應原理相同，是根據鱟試劑在形成凝膠的過程中反應液渾濁度上升的速度和反應液中內毒素濃度成比例的原理所設計的定量法鱟試劑，靈敏度高達0.005 EU/ml，檢測范圍寬，可根據樣本的限值和微生物的生長曲線及樣本監測趨勢定出檢測樣本的預警區間。

37 ℃為鱟試驗最優條件，但實驗對溫度非常敏感，所以設備溫控的精準度是實驗結果準確的重要條件[14]。定量檢測法—動態濁度法所需儀器為帶溫育系統的動力學光度測定儀器及配套軟件，如全進口的ELx808IULALXH為各大國內外公司常用及推薦的內毒素定量檢測設備，帶有4-Zone溫控專利。設備要能符合ISO15189認證，抗干擾能力強，溫控精度高，光路系統精確度、靈敏度穩定；實現批量微量化微板檢測、自動化檢測；符合藥品生產質量管理規范(good manufacturing practice，GMP)及美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)要求，保障準確的實驗結果。

內毒素檢測由醫院檢驗中心及院外有資質的第三方檢驗機構執行，實際操作時有許多因素會影響內毒素檢測結果。對于透析濃縮液早期出現過陽性不合格結果，從影響內毒素檢測結果的相關風險環節查找風險因素及原因發現，濃縮液B液攪拌桶以及B液成品桶微生物指標超標，針對性采取提高消毒頻次，采用多種消毒手段相結合的措施，抑制微生物生長達到有效控制內毒素的質量控制目的。

臨床上有些數據提示，在使用透析液時需要對其進行實時監測。經過透析治療的患者，其內毒素水平并不能馬上降低，甚至短時間內會有所上升[15-6]。具體表現:①患者治療第1 d的內毒素含量為0.95 EU/ml，與正常人相比其數值具有顯著差異(正常人內毒素含量為0.13±0.07 EU/ml)；②治療第3 d，內毒素含量上升至1.63 EU/ml，直到治療第7 d，內毒素含量降至0.65 EU/ml，與未經治療的患者相比，數值具有顯著差異，未經治療的患者內毒素含量在第7 d為1.03 EU/ml；③透析液的貯存時間也會影響血透效果，甚至季節變化到溫度較為適中的月份都會加快革蘭氏陰性菌的生長繁殖[17-18]。因此，血透室要注意配液時間、配液濃度及保存時間等質量進行控制，這主要是因為透析使用的透析液是在室溫下保存，且多次使用于血液透析，透析過程經常未加蓋，透析液處于開放狀態，盛放透析液的器皿未經消毒處理，上述因素使得透析液受到污染，細菌大量繁殖。

5 結論

動態濁度法測試的結果明確顯示出透析系統某些環節內毒素的動態變化，如反滲水管路入口和出口，以及回路的內毒素數值的變化，從而制定相應的解決方案，指導臨床透析的環節質量控制，以提高透析系統的安全性。臨床透析工程學質量控制需按下述要求進行。

(1)經常對反滲透機、供水管路及透析機進行聯動消毒。根據表3的結果，反滲水、出口反滲水、入口反滲水以及反滲水出(回)水口的內毒素檢測均超標，表明應當提高檢測頻次，而有利于預測內毒素的預警區間。消毒時使消毒液充滿系統每個部分，并保持必要的時間，以達到良好的消毒效果。具有熱消毒功能的反滲透機、供液管路及透析機，建議至少每周進行1次聯動熱消毒。

(2)在透析機上加裝超凈濾器(內毒素濾器)，能阻止透析系統中細菌和內毒素的通過，從而有效地降低細菌及內毒素對透析系統的污染，是一種十分有效的方法。目前各大醫院有不同國內外品牌透析機，工藝參差不齊，導致內毒素污染風險加大，建議提高透析機與出水口連接裝置內毒素檢測頻次。

(3)自行配制透析液單位，采用人工、機械攪拌等方式，透析液B濃縮液現用現配，不使用剩余濃縮液。建議使用無菌B濃縮液或聯機B干粉。復用的B液成品桶應每日使用反滲水沖洗、倒置，周期性消毒和更換。

(4)集中配供濃縮液系統的配液間應安裝空調及通風設施和洗手盆，同時應安裝空氣殺菌裝置抑制細菌滋生；配液、供液系統相關容器、管道消毒抑菌控毒應遵從設備生產商的維護要求實施[19]。

患者進行血液透析時，如果透析用水和透析液被微生物污染，則會導致多種并發癥，甚至直接威脅到患者的生命。一旦水解后的內毒素穿過透析膜進入患者體內，便會產生熱源性反應，進而引發低血壓、發熱、肌肉痙攣等癥狀，嚴重時直接導致休克。因此，進行血液透析系統內毒素檢測與控制是必不可少的重要環節。