便攜式核酸微全分析儀的設(shè)計與研發(fā)*

馬俊杰 朱 信 李曉寧 任宇航 吳 丹 趙 爽 胡 笛 徐建棟*

近年來，現(xiàn)場核酸分子檢測是現(xiàn)場快速檢測(point-of-care testing，POCT)的熱點領(lǐng)域，其發(fā)展迅速[1]。目前，面對各種新發(fā)和突發(fā)性傳染病時，最經(jīng)濟有效的防控措施就是建立快速及準確的核酸分子診斷方法[2]。常規(guī)核酸分子檢測手段需要復(fù)雜的樣本處理和擴增技術(shù)，由于氣溶膠的問題，需要嚴格的實驗室分區(qū)及管理制度[3-5]。因此，需要大量的生化檢測設(shè)備和環(huán)境要求嚴格的使用場地，若稍有操作不慎，就會造成污染和假陽性結(jié)果。核酸實驗室污染后極難清除污染物，有可能造成實驗室無法使用的風(fēng)險[6-7]。因此，對實驗室操作人員及日常維護管理提出了很高的要求。由于常規(guī)分子檢測只能在實驗室開展，故現(xiàn)場快速檢測是業(yè)內(nèi)亟待建立并使用的新技術(shù)，研發(fā)出小型化、便攜化、微量化以及能夠在現(xiàn)場進行快速檢測的儀器設(shè)備勢在必行。為此，本研究自主研制一款便攜式核酸微全分析儀及配套微流控芯片，以滿足進出口檢驗檢疫、偏遠地區(qū)快速疾病篩查等特殊環(huán)境下的快速現(xiàn)場分子診斷需要。

1 便攜式核酸微全分析儀設(shè)計思路

在博暉創(chuàng)新GenPlex?微流控全自動核酸檢測系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，將儀器的體積進行幾何量級的壓縮[8]。將關(guān)鍵模塊中多層氣動回路驅(qū)動模塊、聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)溫控模塊以及反向雜交溫控部件等小型化后安裝進小型安全箱中，以方便攜帶。增加微型化熒光檢測模塊，實現(xiàn)儀器熒光信號檢測功能。充分保留GenPlex?微流控芯片“芯片上的分子實驗室”的性能特點，并對微流控芯片進行結(jié)構(gòu)改造，增加熒光檢測窗口，在一個芯片上顯現(xiàn)斑點雜交和實時定量PCR兩種檢測功能。適配多種核酸分子檢測試劑，實現(xiàn)多種目標病原物檢測。便攜式核酸微全分析儀系統(tǒng)見圖1。

圖1 便攜式核酸微全分析儀系統(tǒng)框架

2 便攜式核酸微全分析儀主機結(jié)構(gòu)

便攜式核酸微全分析儀主機為通用型醫(yī)療裝備，外觀采用手提式箱體設(shè)計，便于攜帶和運輸；內(nèi)部由多層氣動回路驅(qū)動模塊、小型氣源、芯片接口模塊(集成PCR溫控模塊，反向雜交溫控部件)、熒光檢測模塊、電器控制系統(tǒng)及PC顯示模塊等核心部分組成。該系統(tǒng)具有體積小、質(zhì)量輕、攜帶便利以及使用方便等優(yōu)點，能夠在檢測現(xiàn)場完成樣品處理(細胞裂解)、核酸提取、基因擴增、擴增子檢測(實時熒光定量，分子分型)等全部檢測過程，真正做到微全分析，可滿足快速現(xiàn)場核酸分子檢測的需要。采用該儀器實現(xiàn)人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)、Y染色體缺失(Y-chromosomal microdeletions，YMD)、禽流感及新城疫病毒等疾病檢測。

2.1 主機系統(tǒng)外殼設(shè)計

便攜式核酸微全分析儀外形尺寸為490 mm×360 mm×208 mm，整機重量13.4 kg；手提箱為工業(yè)級安全箱，由箱體和箱蓋兩部分組成，箱蓋內(nèi)部安裝有工業(yè)級觸屏液晶顯示屏，箱體內(nèi)為主機核心部件。在箱體上方固定有控制面板，面板部分主要包括電源開關(guān)電源指示燈、通用串行總線(universal serial bus，USB)接口和微流控芯片操作區(qū)。電源開關(guān)實現(xiàn)儀器主機系統(tǒng)內(nèi)部電路與外接電源的快捷通斷；指示燈可快速了解主機系統(tǒng)的電路通斷情況，保障操作的安全性；USB接口可以外接鼠標鍵盤，用于操作軟件，也可以通過觸屏液晶顯示屏進行操作。在箱體的側(cè)方留有風(fēng)扇散熱口，可以保證系統(tǒng)適宜的工作溫度。在箱體后方留有外接電源接口，輸入電壓12 Vdc，可適配車載電源，最大功率80 W(圖2)。

圖2 便攜式核酸微全分析儀外觀實物圖

2.2 主機系統(tǒng)內(nèi)部構(gòu)造

分析儀主機系統(tǒng)內(nèi)部由PC機、多層氣動回路驅(qū)動模塊、小型氣源、芯片接口模塊(集成了PCR溫控模塊，反向雜交溫控部件)、熒光檢測模塊、電器控制系統(tǒng)及PC顯示模塊等核心部分組成(圖3)。

圖3 便攜式核酸微全分析儀內(nèi)部構(gòu)造

(1)多層氣動回路驅(qū)動模塊和正負壓小型氣源。多層氣動回路驅(qū)動模塊和正負壓小型氣源構(gòu)成了芯片驅(qū)動系統(tǒng)，通過芯片接口模塊驅(qū)動微流控芯片上的微泵、閥協(xié)同工作，完成整個核酸分子檢測的生化反應(yīng)過程。多層氣動回路驅(qū)動模塊采用多層PMMA氣路集成技術(shù)，集成了壓力傳感器、儲氣罐、氣動閥及控制電路，使得復(fù)雜氣路的控制高度集成，從而實現(xiàn)小型化。正負壓氣泵采用托馬斯的1410系列，12 V供電，該系列氣泵體積小，最大正壓1.0 Bar，最大正壓流速4.3 L/min，最大負壓75%，最大負壓流速3.7 L/min。

(2)芯片接口模塊。芯片接口模塊同樣采用多層PMMA氣路集成技術(shù)，將微型化PCR溫控模塊、反向雜交溫控部件及微流控芯片泵閥氣動接口等實現(xiàn)高度集成。微型化PCR溫控模塊和反向雜交溫控部件具有小型化、低能耗、成本低廉以及熱循環(huán)速度快的特點。該模塊在實驗室的工作環(huán)境下，最高可以達到5～6 ℃/s的熱循環(huán)速度。與小型電扇制冷共用，相比半導(dǎo)體制冷熱循環(huán)器能耗極大降低。圖4為實測的PCR加熱器升降溫曲線:溫度由室溫升至30 ℃，待到平穩(wěn)后，由30 ℃升至55 ℃，中間部分溫度維持在55 ℃，最后降至30 ℃。溫度維持在55 ℃區(qū)間時，溫差≤±0.3 ℃。

圖4 加熱器升降溫曲線

(3)熒光檢測模塊。熒光檢測模塊由4個通路組成，每個通路的光路由激發(fā)光源、準直透鏡、激發(fā)濾光片、二向色鏡、物鏡、發(fā)射接收濾光片、接收聚焦鏡、光電二極管及控制電路組成。每個通道可對應(yīng)檢測某一種或數(shù)種特定波段的熒光染料(圖5)。

圖5 四通道熒光檢測模塊光路

信號采集方式采用橫向掃描，每個芯片會采集≥1000個采樣點，然后根據(jù)采樣點獲得的熒光強度數(shù)據(jù)繪制成曲線，讀出各PCR管式反應(yīng)器對應(yīng)的熒光信號。檢測前，熒光探頭由行程75 mm氣缸牽動而沉于操作平臺的下方，既能保證不與機箱上蓋發(fā)生干涉問題，也能兼顧美觀。檢測時，熒光探頭浮出于平臺上方，并由直線滑臺牽引對芯片下方的PCR管進行掃描，滑臺導(dǎo)軌長度150 mm，滑臺由步進電機和同步帶牽引(圖6)。

圖6 四通道熒光檢測方式

(4)控制系統(tǒng)。控制系統(tǒng)設(shè)計上位機部分主要是基于Java語言的控制軟件和PC工控機組成，下位機主要由運動部件、熒光探頭部件、氣路控制組件以及溫控組件組成。通過串口和CAN通訊實現(xiàn)上下位機的通訊控制，實現(xiàn)相關(guān)部件的運動配合(圖7)。

圖7 控制系統(tǒng)框圖

3 便攜式核酸微全分析儀芯片設(shè)計

微流控芯片為低成本聚苯乙烯芯片，通過芯片上的微通道、泵、閥、反應(yīng)儲液池以及一個DNA微陣列芯片，形成了PCR實驗室的樣品準備區(qū)、擴增區(qū)和擴增反應(yīng)分析區(qū)，可自動完成細胞裂解、DNA的分離和純化及檢測。檢測可以采用基于DNA微陣列芯片的反向雜交技術(shù)或者實時熒光定量(RT-PCR)技術(shù)(圖8)。

圖8 微流控芯片設(shè)計

微流控芯片一次性使用，一次處理4個樣品；僅用1臺該儀器即可在90 min內(nèi)實現(xiàn)從樣本前處理、核酸提取及PCR擴增到RT-PCR或者反向斑點雜交檢測的全過程，構(gòu)成可針對具體檢測目標靈活配置的現(xiàn)場快速檢測技術(shù)。實現(xiàn)HPV、YMD、禽流感以及新城疫病毒等疾病檢測。

4 便攜式核酸微全分析儀應(yīng)用效果

便攜式核酸微全分析儀可以對唾液、血液、尿等體液樣本進行分析。使用該儀器，實現(xiàn)HPV、YMD、禽流感、新城疫病毒等疾病檢測，其中HPV和YMD檢測采用反向雜交法，禽流感和新城疫病毒采用實時定量PCR法。

4.1 HPV病毒檢測

針對HPV基因組L1區(qū)設(shè)計特異性引物和探針，采用PCR體外擴增和DNA反向雜交法相結(jié)合的生物芯片技術(shù)，用于體外定性檢測女性宮頸樣本中HPV的DNA并進行基因分型，見表1。

4例臨床樣本(宮頸脫落細胞)檢測結(jié)果，見表2。

表1 DNA陣列芯片點樣對照表

表2 HPV檢測結(jié)果

4.2 YMD檢測

以Y染色體AZF區(qū)的6個STS位點(AZFa:sY84、sY86；AZFb:sY127、sY134；AZFc:sY254、sY255)為靶序列，見表3。

表3 DNA陣列芯片點樣對照表

設(shè)計特異性PCR擴增引物及反向雜交捕獲探針，采用多重PCR-反向斑點雜交法快速定性檢測人Y染色體3個AZF區(qū)的6個STS位點是否存在缺失，從而輔助診斷男性不孕不育患者的病因分析。

4例臨床樣本(EDTA抗凝外周血)檢測結(jié)果，見表4。

4.3 禽流感檢測及新城疫病毒檢測

實驗樣本為禽流感尿囊液、新城疫尿囊液樣本及陰性對照。將待測樣本加入到芯片加樣孔后，在芯片上微泵的驅(qū)動下，首先進行病毒核酸的提取，然后針對目標靶點進行熒光PCR或者熒光RT-PCR的擴增，在擴增的同時進行熒光采集。實驗結(jié)果為敏感性及特異性考察，其中特異性要求與新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、鴨瘟病毒及鴨肝炎病毒無交叉反應(yīng)(圖9、圖10)。

表4 YMD檢測結(jié)果

圖9 禽流感檢測結(jié)果

圖10 新城疫病毒檢測結(jié)果

5 討論

近年來，嚴重急性呼吸道綜合癥(severe acute respiratory syndrome，SARS)、禽流感及口蹄疫等事件接連不斷的爆發(fā)，給公共安全帶來了很大的風(fēng)險，不僅對社會經(jīng)濟造成了巨大損失，也對人類的生活環(huán)境乃至健康安全構(gòu)成了越來越嚴重的威脅，突發(fā)性外來傳染病已成為全球關(guān)注的焦點[9]。外來動物入境前臨床檢疫，已成為抗擊外來傳染病入侵的重要關(guān)口，早發(fā)現(xiàn)、早治療，將病情控制在初期是重要的防御手段，快速、便捷且高通量的新型便攜式現(xiàn)場核酸分子檢測方法在口岸檢測中具備巨大的應(yīng)用前景[10-11]。開展地方病監(jiān)測，常規(guī)手段需要大量的生化檢測設(shè)備和環(huán)境要求嚴格的使用場地，而少數(shù)民族等偏遠地區(qū)受醫(yī)療衛(wèi)生條件的限制，開展相關(guān)工作存在很大困難，致使這些地區(qū)發(fā)病率和病死率高。開發(fā)靈活、快速及低成本的小型分子診斷設(shè)備，可為偏遠地區(qū)疾病檢測提供很好的技術(shù)支持[12]。

現(xiàn)有的常規(guī)核酸的檢測方法要經(jīng)過樣品前處理、核酸提取及PCR擴增等過程來完成，需要約2 d時間做出診斷，而現(xiàn)有的檢測設(shè)備，只能在條件很好的實驗室環(huán)境中工作，無法實施現(xiàn)場快速檢測[13]。因此，亟待研發(fā)出能夠在現(xiàn)場進行快速檢測的儀器設(shè)備，為動物檢疫和地方病檢測等相關(guān)工作提供技術(shù)支撐。

本研究的便攜式核酸微全分析儀具有自動、封閉、快速及靈敏等技術(shù)特點，可以在非分子實驗室環(huán)境完成HPV、YMD、禽流感及新城疫病毒等檢測項目，應(yīng)用場所將從如今的中心實驗室普及至檢測現(xiàn)場，不需高水平的實驗室條件、復(fù)雜的實驗步驟和有經(jīng)驗的操作者，將極大地降低成本，提高檢測效率，有望在病原體篩查、感染監(jiān)測、檢驗檢疫、食品衛(wèi)生檢驗等諸多領(lǐng)域發(fā)揮積極作用。

6 結(jié)語

便攜式核酸微全分析儀以快速和現(xiàn)場檢測為特點，是微全分析系統(tǒng)的一項重大應(yīng)用，是微流控儀器設(shè)備開發(fā)應(yīng)用中的重要組成部分，可以滿足現(xiàn)場疾病篩查和動物檢疫的需求，是微流控芯片應(yīng)用與產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)飛躍。隨著精準醫(yī)學(xué)的發(fā)展，分子檢測技術(shù)將迎來新一輪產(chǎn)業(yè)革命，未來將有越來越多的小型化、自動化的分子診斷相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品涌現(xiàn)，為提高人民的健康水平服務(wù)[14-15]。