外泌體檢測及其臨床應用研究進展*

林慧嫻 劉春辰 鄭 磊*

外泌體作為細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)的一種類型，以信號介質的形式參與了機體眾多生理病理過程，例如細胞分化、細胞增殖、血管新生、炎癥免疫反應以及腫瘤轉移與耐藥等，在揭示疾病機制的基礎研究與疾病診斷、預后評估、靶向治療等臨床應用中極具發展前景。通過聚焦于分離富集、鑒定與內容物分析這三大視角，簡要總結外泌體的檢測技術，并對其原理和優缺點進行客觀評價，這對外泌體檢測新技術的開發與臨床應用進程的推進具有深遠意義。

1 外泌體的生物學特性

外泌體是細胞外環境中含脂質雙分子層的一種膜性囊泡，呈杯狀和(或)雙凹碟狀，直徑為30～100 nm，密度為1.11～1.19 g/ml[1-2]。外泌體不僅可以被大多數細胞分泌，還可被細菌[3]和病毒[4]分泌，存在于血漿、血清、唾液、羊水、母乳和尿液中，具有特異性的蛋白質、活性的核酸和脂質，在細胞間的物質傳遞、信息交流、細胞增殖分化、血管生成、免疫調節等過程中發揮重要的生物學作用，并參與了腫瘤以及心血管、消化、免疫、神經等系統疾病的病理過程，有望成為一種新型的疾病診斷標志物。

2 外泌體的主要分離富集技術

外泌體以非均一膜性囊泡的結構散在存在于成分復雜的人體體液標本中，因此外泌體的分離富集是其檢測技術的關鍵環節，所得外泌體的純度與活性可直接影響后續的鑒定與功能分析。目前，常用的外泌體分離富集技術主要基于外泌體的物理特性(大小、密度等)與免疫學特征，具體原理與優缺點見表1。

3 外泌體的鑒定分析技術

外泌體是EVs的一種類型，為保證不同研究機構研究結果的可信度與重復性，國際細胞外囊泡協會(International Society for Extracellular Vesicles，ISEV)于官方會刊(Journal of Extracellular Vesicles，JEV)發布了EVs研究最低要求(minimal information for studies of EVs，MISEV)的國際研究指南。參考MISEV的建議，外泌體的鑒定主要包括形態學特征、濃度和(或)徑粒、蛋白分子表征鑒定，可累加組分的拓撲鑒定[14-15]。

針對外泌體的形態學特征，掃描電子顯微鏡[16]、透射電子顯微鏡[17]、原子力顯微鏡[17]以及隨機光學重構顯微鏡[18]等可直觀地表征外泌體的形態學特征，如直徑、形狀等。其中透射電子顯微鏡可觀察外泌體的內部結構，原子力顯微鏡可提供三維表面圖，隨機光學重構顯微鏡在提高成像分辨率的基礎上還可進行目標分子的精確定位。但此類方法不適合大量樣本與濃度鑒定。除原子力顯微鏡外其余方法均需復雜的預處理，脫水固定或是熒光染料染色等均可能影響其活性，不利于后續功能分析。

表1 常用外泌體分離技術比較

外泌體的量化，納米粒子追蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)[19]與動態光散射(dynamic light scattering，DLS)[20]則可對外泌體進行實時濃度與徑?？梢暬治?。前者適用于單和(或)多分散性樣本，但無法區分樣本表型；而后者對均質性樣本分析靈敏度高，但不適于非均質樣本，因為小顆粒光強波動信號極易被大顆粒所掩蓋?？烧{諧電阻脈沖傳感技術[21]通過對瞬時電流的檢測亦可實現對外泌體濃度與尺寸等進行精確鑒定。常規和(或)高分辨率流式細胞術也適用于外泌體的粒子數分析。此外，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)、比色法如二喹啉甲酸法(Bicinchoninic acid，BCA)[22]等測總蛋白；熒光測定法(如親脂性熒光染料DiR)[23]、全反射傅里葉變換紅外光譜[24]等測總脂質；毛細管電泳獲得圖譜測總RNA與酶聯免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、流式細胞術等測特異性分子，亦可獲得外泌體的濃度信息。

外泌體蛋白分子表征的方法主要包括ELISA、蛋白印跡法(Western blot)、質譜法及流式細胞術等。根據MISEV的規定，需要選擇驗證至少3種陽性蛋白標志物(包括跨膜、胞漿及脂質結合型蛋白)與至少1種陰性蛋白標志物的表達來進行外泌體的鑒定。

外泌體的拓撲鑒定主要是針對外泌體的膜蛋白與囊泡內蛋白而言，為其功能研究的進一步深入提供思路。具體可用蛋白酶K處理或胰蛋白酶和(或)胞內蛋白酶Lys-C處理并生物素化后經柱分離，液相色譜串聯質譜或質譜進行蛋白組學分析，流式細胞術與熒光顯微鏡法進一步驗證分析，并結合生物信息學完成鑒定[25]。在此過程中，亦可累加原子力顯微鏡、場發射掃描電子顯微鏡等手段進行輔助分析[26]。

4 外泌體的內容物分析技術

外泌體可選擇性包裹核酸、蛋白質和脂質，真正具有診斷意義的是這些表達了疾病特異蛋白或核酸的外泌體亞群。因此，基于外泌體的臨床診斷技術的開發大多聚焦于外泌體亞群內容物的檢測。

在疾病特異外泌體核酸亞群的研究中，多采用與血清核酸類似的檢測技術:利用二代測序技術或雜交芯片技術[27]對外泌體差異表達的核酸進行篩選，再用實時熒光定量PCR[28]或液滴數字PCR進行驗證[29]。

疾病特異外泌體蛋白質標志物的檢測是外泌體亞群分類分析的另一重要組成部分。蛋白標志物的篩選多采用標記、非標記蛋白質質譜[30]或蛋白芯片技術[31]對外泌體差異表達的蛋白進行篩選，再用Western blot[32]、納米流式技術[33]、ELISA及平行反應監測等進行驗證。

近年來，關于外泌體核酸和蛋白質綜合檢測技術的研究眾多且日趨成熟，涌現出一批外泌體檢測平臺，并將其用于疾病的診斷與預后監測。常見外泌體檢測平臺有光學、電化學和小型微流控檢測平臺，在分析靈敏度、特異度、檢測儀器的微型化、自動化與便捷化上均具有顯著優勢，有望在未來實現即時檢測(point-of-care testing，POCT)，見表2。

表2 新型檢測平臺列舉

5 外泌體的臨床應用

外泌體廣泛散布于機體中且運載著多種分泌源細胞的信號分子，是頗具臨床價值的循環疾病標志物。與組織病理檢查相比，基于血液等體液外泌體的檢測方法，患者接受程度更高，便于進行病情監測，更能反映疾病整體情況。與傳統血清游離核酸及蛋白標志物相比，外泌體具有顯著的靶向性、包含更大量信息、易于保存、檢測基質的干擾小等優勢。

在惡性腫瘤疾病中，對外泌體內核酸分子的檢測展現出極高的診斷應用價值。例如胃癌患者的外泌體miR-423-5p[44]表達水平顯著升高，提示其可成為胃癌診斷的標志物，臨床試驗亦進一步證實外泌體miR-423-5p的診斷靈敏度與特異度分別為81.0%和57.5%，高于傳統的血清學標志物CA-199和CEA。在心血管疾病中，受損內皮細胞分泌異常外泌體，能夠準確反映病變組織的病理情況，是心血管疾病診斷的良好標志物[45]。糖尿病患者血漿中外泌體水平顯著高于健康人群，患不同并發癥的糖尿病患者，相應外泌體的內容物表達譜與表達水平也會出現相應改變，如miR-320c[46]/miR-145[47]以及miR-126[48]分別與糖尿病患者的腎臟病變和心肌損傷有關，有望成為預測糖尿病患者并發癥發生風險的診斷標志物。

除惡性腫瘤、心血管疾病以及糖尿病外，其他如神經系統退行性疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病等均與外泌體的異常密切相關。在神經退行性疾病中，聚集的β淀粉樣蛋白具有結合循環外泌體的特性，并且證實通過檢測β淀粉樣蛋白陽性的循環外泌體水平可以反映患者的神經病變進展[49]。外泌體還可通過產生免疫復合物、抗原提呈以及凝血等過程，參與自身免疫性疾病[50]。病毒感染的細胞釋放的外泌體可將病毒RNA遞送到樹突細胞和巨噬細胞，從而激活受體細胞的模式識別受體，誘導I型干擾素和促炎細胞因子的表達，增強機體抗病毒能力[51]。

6 展望

外泌體作為疾病標志物，用于疾病“液體活檢”具有巨大的前景。從以上研究可發現，外泌體檢測技術的準確可靠性是外泌體全面發揮其應用潛力的必要條件。雖然隨著對外泌體認識的不斷加深，涌現出了許多新型檢測技術，但到目前為止尚無任何方法可視為外泌體檢測的金標準。如何在檢測特異性、靈敏度以及回收率、分離純度與成本上取得平衡仍是亟待解決的問題。再者，各檢測技術缺乏統一標準的規范化操作指南，質量控制體系也處于起步階段，這極大限制了外泌體的應用。未來將聯合分子生物學、光學、聲學、電磁學、機械自動化、計算機技術以及納米材料和傳感器等多學科優勢開發新檢測技術，提高檢測準確性，促進其微型化與自動化發展。此外，進一步探究外泌體的生物學特性，有利于新檢測技術開發，亦有利于其臨床有效性與實用性證明，對推進外泌體的應用進程具有深遠意義。