應用二代測序技術進行胚胎植入前遺傳學篩查及診斷的基本原理*

李麗莉 孫 楠 張文新 林一鑫 方雅亮 梁家杰 黃 杰* 曲守方*

遺傳學和基因組學的快速發展對人類生命健康及繁衍的影響日益深遠，對多種常見和罕見疾病的研究有助于對應預防、檢測及治療方法的開發，從而提高患者及其家人的生活質量。在不孕不育等問題日益嚴峻的情況下，輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)應運而生并被采用于個性化的生育治療策略，幫助受生育難題困擾的家庭。其中，植入前遺傳學篩查(preimplantation genetic screening，PGS)主要針對高齡、反復助孕失敗、反復自然流產等患者，進行植入前胚胎的染色體畸變檢測，用于篩查和丟棄染色體畸變的胚胎，保證受孕者所植入的胚胎具有正常染色體組的同時，解決因胚胎染色體畸變而導致的植入失敗和反復流產現象，并提高妊娠率[1-2]；植入前遺傳學診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)則主要針對父母本已患有明確遺傳病或攜帶其致病基因，在種植前對胚胎進行相應遺傳學診斷，主要包括單基因遺傳病和染色體病(如羅氏易位、平衡易位等)，通過選擇無致病因素的胚胎進行植入，以提高生育健康嬰兒的概率[3]。

1990年，Handyside等[4]首次使用基于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術的PGD對可能攜帶X-染色體連鎖致病基因的胚胎進行性別選擇。經過不斷的發展，當前應用于PGD的PCR技術主要包括逆轉錄PCR、巢式PCR、熒光以及實時熒光定量PCR等，主要用于鑒定胚胎特定基因的點突變、小片段缺失或插入等。但PCR技術的主要問題在于通量低、樣品易被污染、擴增失敗和等位基因脫扣(allele drop-out，ADO)等，因此準確性波動大，且檢測效率低[5]。而等位基因脫扣是PCR乃至二代測序(next-generation sequencing，NGS)(基于NGS的PGD基本需要進行多重PCR)中最難以解決的問題，具體指在兩個等位基因中的一個擴增完全，而另一個擴增失敗，發生率約為5%～15%，其原因可能包括欠佳的PCR環境、細胞裂解不完全、DNA降解、某片段鳥嘌呤和胞嘧啶(guanine and cytosine，GC)含量值高等[6-7]。PCR通常不應用于PGS，但目前也有應用熒光PCR進行染色體整倍體檢測的少量報道[8]。

另一早期廣泛應用于PGD的標準技術是熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)，1994年該技術被首次應用于胚胎性別診斷[9]。FISH采用熒光標記的特異性探針與處于分裂間期的胚胎卵裂球染色體DNA雜交，通過觀察熒光信號的數量和分布，鑒定胚胎性別或判斷染色體是否平衡[10]。但由于卵裂球的固定效果不穩定，探針也存在非特異性結合的情況，因此容易出現不可靠的結果[11]。傳統的FISH無法一次性檢測所有染色體，一般每個卵裂球細胞只能標記5條染色體，一次實驗耗時5 h左右，因此很少用于PGS，直至近年才有采用FISH進行染色體整倍性的檢測報道[12]。

比較基因組雜交技術(comparative genomic hybridization，CGH)利用不同顏色的熒光標記待測樣本和對照組的基因組，然后與正處于人類中期染色體雜交，最后通過兩組熒光強度的差異，判斷染色體的重復和缺失，其分辨率比FISH高5～10 M[13-14]。由于傳統的CGH需要制備人類中期染色體，操作較為繁瑣，因此在微陣列技術出現后，比較基因組雜交技術與之結合形成了微陣列比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization，array-CGH)并廣泛應用于PGS/PGD。

基于對胚胎發育健康的考慮，所有的植入前檢測都盡量取用最少量的胚胎細胞，但這也容易造成待測DNA量過少的問題。因此，全基因組擴增技術(whole genome amplification，WGA)應運而生。WGA非選擇性地對全基因組序列進行擴增，即增加了DNA總量，也避免了序列傾向性，實現了微量DNA多基因位點分析和重復檢測。WGA可與NGS或微陣列比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization，array-CGH)技術結合應用于PGS/PGD。

array-CGH結合傳統的CGH技術和基因芯片技術，是一種高通量分子細胞遺傳學檢測技術。該技術主要運用不同的熒光信號標記所檢樣本和標準參考品，使其競爭性地與芯片上微陣列分布的探針進行雜交，進而分析兩標本的信號強度，判斷染色體組的重復和缺失[15]。但當染色體片段＜500 bp時，array-CGH技術的結果失誤率高，不能檢測單倍體和一些多倍體，無法準確分辨正常與平衡染色體易位攜帶者的胚胎，也不能追蹤每個染色體的來源，因而不可用于單親源性二倍體的檢測[14，16]。

SNP微陣列(single-nucleotide polymorphism array，SNP array)用于檢測基因組中特定位點單核苷酸的多態性，該多態性出現的頻率為1/500～1000 bp[17]。該檢測技術分辨率極高，可用于單基因遺傳病PGD的檢測，且全基因范圍的SNP檢測也可以體現片段重復、缺失及染色體整倍性的信息，因此也可用于PGS/PGD[18]。但由于其成本昂貴，加上無法檢測平衡易位的缺點，因此難以進行廣泛的應用。

NGS技術使用了一種新的測序策略——循環芯片測序法，是一種重復在布滿脫氧核糖核酸樣品的芯片上進行DNA的聚合酶反應和熒光序列讀取反應的高新技術，具有高通量、較低成本、耗時少、自動化程度高、可檢測未知缺陷和嵌合體[19]等優點，可以一次性對多樣本進行測序，適用于遺傳異質性較強的單基因遺傳病的突變篩查。NGS技術用于PGS可以診斷胚胎基因組的染色體變異、微重復及微缺失，用于PGD可實現單基因病的檢測[20]。目前多家生殖技術公司都采用NGS技術提供輔助生殖服務，故針對應用NGS進行PGS/PGD的基本原理進行深入闡述。

1 NGS在PGS中的應用原理

應用單細胞全基因組擴增(whole genome amplification，WGA)技術，結合NGS對23對染色體進行全面的染色體非整倍體性、微缺失及微重復異常的篩查，從而篩選出適合于種植的優質胚胎，降低因胚胎染色體異常導致的流產風險，提高妊娠率。

1.1 實驗原理

首先需要采用胚胎活檢技術對胚胎細胞進行取樣，早期采用極體細胞進行PGS/PGD，但由于極體只能反映母本的遺傳信息，因此目前的應用有顯著下降的趨勢；卵裂球活檢雖然是對胚胎細胞的直接檢測，但在卵裂期吸走1～2個細胞的操作，很可能影響胚胎的發育潛能[21-22]；應用最廣的是滋養層細胞活檢，該階段可以取得10個以上的細胞，而起始檢測量的增多有利于測序準確性的提高[23]。然而，對滋養層的取樣對內細胞團幾乎無影響，因此也不對胚胎正常發育造成負面影響[9]。

采集滋養層細胞后，進行單細胞全基因組擴增，通過對擴增產物進行高通量測序，得到數以萬計的堿基序列讀段(reads)，與人類基因組參考序列比對，可將reads定位到基因組上。而后通過選取一定長度的窗口，可對窗口內的reads進行計數，從而作為該窗口的信號值，該信號會隨著測序深度的增加和窗口的增大而趨于穩定，這些擁有穩定信號值的窗口就是用于判定染色體異常的基礎。對于二倍體的區域，將其信號值與正常值比較，則可判定為染色體正常、重復或缺失。

1.2 數據分析原理

數據分析分為基礎分析和特定分析兩大步驟。

(1)基礎分析由測序儀自帶程序進行，其中包括獲得原始數據、數據過濾、序列比對及生成比對結果4個步驟:①在Illumina平臺上獲得的原始數據預設為fastq格式，而ThermoFisher平臺預設為bam格式；②基本數據過濾可將測序質量值＜17且序列長度＜35 bp的片段(即低質量數據)除去，以提高比對結果的可靠性；③序列比對通過計算得到序列對應參考基因組的位置，常用的比對軟件有Bowtie 2[24]及BWA[25]等；④比對后輸出結果為bam格式。

(2)基礎分析后，可根據不同的醫學需要選擇特定的分析，用于PGS的數據分析則需要繼續進行去除重復序列、有效讀數計算、GC校正及CNV分析4個步驟:①去除重復序列用于除去由于PCR擴增偏好引起的重復序列，序列比對方向一致且起始位置一致即被認為是重復序列，這一步的常用軟件有SAMtools[26]及Picard tools等[27]；②有效讀數計算中，常用的有比對質量值≥10且序列長度＞35 bp的片段被認為是有效片段；③GC校正用于去除由于GC含量引起的PCR擴增偏好性；④讀深度法(read-depth method)[28-32]是目前CNV分析的標準方法，即首先將讀段比對到參考基因組，如果該染色體不存在結構變異，那么一定長度區FF域(即“窗口”)內比對到的讀段總深度是固定的。如果該染色體存在重復或缺失，那么重復區域的讀段總深度會多于該固定值，而缺失區域的讀段總深度會少于該固定值，見圖1。

圖1 使用讀深度法進行CNV分析原理示意圖

該方法的運作需要結合統計模型(PGS一般采用隱馬爾可夫模型)，上一步GC校正剔除了高GC含量區域的PCR擴增偏好性這一影響因素，使得候選變異范圍內的序列深度可以正確反映拷貝數。然后利用隱馬爾可夫模型模擬實際的序列深度，最后按照模型以及劃分算法(PGS一般采用循環二元分割法[28])判斷變異所處的區域。

窗口長度的選取是上述流程的關鍵步驟，直接關系到檢測結果的假陽性和(或)假陰性率[33]。當窗口過短時，在某些區域的讀段數過少，從而引發一種非均勻波動，并最終導致假陽性和(或)假陰性率升高。而針對特定的樣本，可以根據窗口長度計算出對應的錯誤發現率(false discovery rate，FDR)。窗口愈長FDR愈低[34]。但窗口過長會降低分辨率，使檢測失去意義，因此需要在FDR可接受的范圍內，選擇最佳的窗口長度[28]。PGS的測序深度一般為0.1 X，該測序深度下常用的窗口長度為1 M。當某1 M片段存在拷貝數變異且該變異在Decipher、Clinvar等數據庫中可查時，報告中會有相應的報道；如果有拷貝數變異的片段在數據庫中無記錄，則只有當該片段＞10 M時才會有所報道。

1.3 技術優勢

該檢測方法能全面覆蓋23對染色體；可進行胚胎嵌合分析；分辨率高；樣本處理高效快捷，能夠實現鮮胚移植。

1.4 適用人群

該檢測方法可用于自然流產3次及以上，或2次自然流產且其中至少1次流產物檢查證實存在病理意義的染色體或基因異常的患者；反復種植失敗(移植優質胚胎3次及以上，或移植≥10個可移植胚胎)的患者；嚴重的男性不育患者即存在少弱精子癥、畸精癥等癥狀的患者。

1.5 報告解讀

在報告解讀方面，拷貝數變異(copy number variation，CNV)分析完成后，會與參考基線相比。胚胎在無偏差時被判斷為正常。為了顯示方便會生成散點圖，當點明顯在基線上部(增益+)或下部(損失-)時，即存在拷貝數變異。Decipher、Clinvar、UCSC等常用數據庫可用于檢索并解讀CNV，其中Decipher數據庫記錄了每一例CNV的染色體位置、純合與雜合情況、致病性、表現型等信息；Clinvar數據庫記錄了CNV所在的基因、致病性等信息；UCSC數據庫則可以查看特定CNV是否位于基因的功能性區域。

如果報告有嵌合體，一般30%以下被認為是可接受的正?，F象，極大可能是由實驗操作引起；如果報告結果為“未檢測到DNA”，原因可能是分析管中無細胞存在或者質量差的樣品。質量差的樣本可能與質量差的胚胎相關。

2 NGS在PGD中的應用原理

胚胎PGD服務結合了高通量測序技術，對囊胚期滋養層細胞進行全基因組擴增，并對家系樣本進行捕獲測序和單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析，以獲得夫婦及先證者致病基因連鎖單倍型信息，再根據胚胎樣本的測序信息判斷是否遺傳了父母親的致病單倍型，輔助臨床上選擇無致病基因攜帶或受遺傳病影響最小的胚胎進行植入，阻斷家族性遺傳病的垂直遺傳，提高遺傳病患者或攜帶者生育健康嬰兒的概率，降低新生兒的出生缺陷率。

2.1 技術原理

PGD基于SNP連鎖分析原理，根據不同的單基因病設計panel，隨后進行目標區域捕獲及高通量測序，擴增位于突變位點附近的短串聯重復(short tandem repeat，STR)多態性標記(STR是核心序列為2～6個堿基的短串聯重復序列，大部分為雜合且個體之間的差異很大)。與突變的等位基因連鎖的STR長度值可以通過在PGD之前使用父本和母本基因組DNA的片段分析來確定，且胚胎的基因型可以在PGD期間通過SNP連鎖分析來診斷。除了通過限制性長度多態性或微量測序的直接突變技術之外，使用與突變位點連鎖的多個STR標記物有助于克服ADO導致的誤診問題。確定胚胎的基因型后，結合對23對染色體非整倍性進行分析，為選擇健康胚胎提供可靠依據。

2.2 數據分析原理

PGD的數據分析同樣分為基礎分析和特定分析兩大步驟，其中基礎分析的內容及步驟與PGS部分的基本一致，也是進行去除重復序列、序列排序，然后就是變異位點分析及單體型分析。

變異位點分析(call variant)根據樣本基因組每個位點與參考基因組的比對情況，判斷該位點是否發生突變，從而確定該位點的基因型；最后一步是單體型分析，一般采用SNP單體型連鎖分析。位于一條染色體特定區域的一組相互關聯，并傾向于以整體遺傳給后代的SNP的組合，稱為單體型。SNP單體型連鎖分析即是以致病基因上下游SNP的整體組合來代表基因存在與否，通過識別一條包含致病基因的DNA鏈來代替單個基因位點的識別，最大限度則是比對同一位點上父本、母本及胚胎的基因型，判斷胚胎該位點2個堿基的來源。假設這是一個家系的SNP位點，如第一行所示，如果子代胚胎在該位點的基因型是CC，且該位點父母的基因型都含有C，則無法確定子代的C分別來自于親本的哪一方；但如第二行所示，該位點的父母本及親本胚胎基因型分別為CG、GG及CG，那么可以明確子代胚胎的C來自父親且G來自母親。以此規則，分析諸多SNP位點，可將子代基因型的父源鏈及母源鏈區分開，即形成子代胚胎的單體型。據此，如果已知致病基因在父源的某一條鏈上，則可通過分析子代是否攜帶此鏈來判斷子代是否遺傳了父親的致病基因。只要發現子代攜帶了致病鏈，即使在活檢細胞擴增中父源致病基因擴增為陰性，也能輔助判斷出致病基因的存在。

通過SNP連鎖分析可以對ADO進行校正，例如，當父母本的基因型都為CC，但是子代基因型卻出現了CG，則證明該G可能是ADO的結果，可考慮將其校正為C(圖2)。

圖2 SNP連鎖分析原理示意圖

2.3 技術優勢

在無先證者資料的情況下，也可進行分析；可檢測新發突變；測序深度高，可精確定位致病位點；可以解決等位基因脫扣問題。

2.4 適用人群

該檢測方法可用于雙方或一方核型異常的夫妻；單基因遺傳病患者或攜帶者夫婦；有家族遺傳病史且明確致病位點的夫婦；已生育過遺傳病患兒且欲通過輔助生殖生育的夫婦。

2.5 適用的單基因病

常見適用于PGD的單基因病見表1。

2.6 適用的染色體異常疾病

由于NGS無法檢測出DNA拷貝數無變化的染色體結構變異，包括羅氏易位和平衡易位，因此目前常用的方法是首先進行常規染色體核型分析，如果顯示為染色體羅氏易位攜帶者或平衡易位攜帶者再進行PGD。

表1 常見適用做PGD的單基因遺傳病

2.6.1 羅氏易位

羅氏易位指2個近端著絲粒染色體在著絲處或其附近斷裂后，二者的長臂在著絲粒處結合在一起，形成一條由長臂構成的衍生染色體，2個斷臂則構成1個小染色體，小染色體往往在第二次分裂時丟失。最終長臂數不變，短臂數減少2條[35]。通常發生在5條近端著絲粒染色體(13、14、15、21和22號染色體)上，其人群攜帶率約為1.23/1000，約占不孕人群的2%～3%[36]。

羅氏易位攜帶者PGD檢測基于新一代測序技術，通過設計特異性引物，采用多SNP連鎖分析的方法，構建單體型，鑒別衍生染色體，與正常染色體相互驗證，結果準確率高。該檢測適用于常染色體核型分析結果為染色體羅氏易位攜帶者，有利于醫生對羅氏易位攜帶者提供遺傳咨詢和臨床決策，進行植入前診斷可有效防止患病兒出生，有利于優生優育，使羅氏易位攜帶者患者有機會優先選擇完全正常的胚胎，阻斷該羅氏易位染色體在家族中的遺傳。

2.6.2 平衡易位

平衡易位又稱相互易位，是指2條染色體發生斷裂后相互交換，形成2條新的衍生染色體，大部分平衡易位對基因表達和個體發育無嚴重影響，但平衡易位攜帶者會形成染色體不平衡配子，引發流產或復發性流產[37]。

平衡易位攜帶者PGD檢測采用高通量測序技術，通過精確定位斷點與其連鎖SNP位點，再通過斷點分析進行診斷，從而可以篩查完全正常和平衡易位攜帶者胚胎。

該檢測有利于醫生對平衡易位攜帶者提供遺傳咨詢及臨床決策。即使本次助孕胎兒為平衡易位攜帶者，患者下次助孕及后代尋求助孕時可以利用已知的斷點及相關信息區分染色體平衡易位核型與完全正常核型胚胎，防止生育后代畸形或促發自發性流產；同時有利于優生優育，使平衡易位攜帶者有機會選擇完全正常的胚胎，阻斷該平衡易位在家族中的遺傳。

3 應用NGS進行PGS/PGD的局限性

NGS對PGS/PGD的各方面發展都有正面的影響。但在現階段，NGS本身仍存在技術局限性。由于NGS采用基于鳥槍法的測序策略，因此無法檢測出DNA拷貝數無變化的染色體結構變異；基因組中存在目前NGS難以準確分析的區域；對新發或罕見變異的解讀有難度等。這些問題可能直接或間接地導致了PGS/PGD的誤診問題[38]。

目前的NGS技術及生物信息工具不能對同源區、重復區及高GC區域進行可靠的分析解讀。目的基因的同源區域存在假基因，其序列與目的基因高度相似，因此在PGD中，如果擴增子來自于假基因，生物信息工具并不能很好地將其剔除，而可能導致與參考基因組的錯誤比對，使得假陽性和(或)假陰性率升高。這是鳥槍法測序策略的固有弊病，要解決這一問題，可能需要新的測序策略及儀器，例如長測序法[39-40]即先擴增出長片段的PCR產物再進行測序，讀段的增長能夠有效地減少錯誤比對的現象；基因組的重復區側翼存在特定的序列，讀段比對到這些特定序列后，可以確定重復序列的長度，但是如果重復區的長度大于DNA插入片段長度，該重復區將不含有側翼序列，因此難以進行準確的比對[41]。在poly T區域，由于測序酶容易在該區域滑動，因此容易發生測序錯誤；高GC區域則主要由于形成二級結構而導致高背景噪聲及低測序準確度。

目前，遺傳學及基因組學的發展仍難以支持對NGS測序數據的充分解讀。數據解讀主要依賴以下幾類資源:數據庫(包括公開數據庫、私有數據庫及實驗室特有數據庫)、醫學文獻、患者信息、臨床經驗及小組討論。雖然數據庫在數據解讀中極為有用，但不同的數據庫側重點不同且無高度綜合性的數據庫。數據庫可能存在錯誤且更新不及時，因此可能存在相互矛盾的數據(例如某個突變體在舊的標準下被歸類為致病突變)[42]；目前的數據庫難以給出雙基因或多基因效應的相關內容；位于內含子及非編碼區的突變的效應通常是未知的，位于外顯子的新發突變或罕見突變也難以解讀[43]；移碼突變和終止突變通常是致病的，但也存在例外[43]；錯義突變則更加難以解讀，因此需要考慮多方面的因素，包括該突變與已知致病突變的相似性、相對于另一已知突變的順式狀態、是否為新發突變、是否存在于其他個體(人群、患病或健康的家庭成員)及預測的蛋白質改變等[44]。

基于上述現象，即使進行了PGS/PGD，也有可能無法檢測到所有潛在出生缺陷。所以如果對NGS的結果有疑問，可能需要使用其他方法進行驗證。就植入前檢測而言，如果對非整倍體篩查的結果有疑問，可使用aCGH進行驗證。或者在植入后，孕10～14周進行產前診斷[45](絨毛膜絨毛取樣或羊膜穿刺術)以確認胎兒染色體是否無缺陷。因此，雖然NGS的應用范圍越來越廣，但是其他技術也因其各自的優勢而有一定的應用面，具體見表2。

4 應用NGS進行PGS/PGD的其他影響因素

4.1 PGS/PGD實驗室的建立及管理

實驗室的建立應嚴格按照中華醫學會生殖醫學分會發布的“高通量基因測序植入前胚胎遺傳學診斷和篩查技術規范(試行)”，且實驗室必須建立在經省級醫療行政管理部門批準開展植入前遺傳學診斷技術的試點或正式運行的醫療機構。

表2 不同檢測技術在特定檢測項目上的應用比較

PGS/PGD實驗室應建立詳細的標準操作流程，且應及時自查并更新；必須對實驗技術人員進行嚴格的培訓，在實驗中嚴格阻隔外源DNA的污染，嚴格進行標本的標記及確認，嚴格按照規范進行數據收集及分析。以上操作中如果存在缺陷，則很可能對結果的準確性造成影響。

4.2 授精及胚胎培養方式

必須嚴格采用ICSI授精方式，防止精子滯留于透明帶中而被父源遺傳物質污染[46-47]；為避免母源遺傳物質的污染，在ICSI前應將卵丘顆粒細胞清除[48]；為保證活檢取樣的準確性，胚胎應嚴格采用單滴培養，確?；顧z樣本與活檢后的胚胎嚴格一一對應。如果上述中存在污染現象，將嚴重影響PGS/PGD結果的準確性。

4.3 活檢方法

胚胎活檢作為一項創傷性的顯微操作，需要十分謹慎的操作。如果操作不當或者方法選擇不當，不僅會影響活檢后胚胎的發育能力，對活檢樣本也可能造成損傷，從而影響PGS/PGD結果的準確性。活檢前需要在透明帶上打孔，目前打孔方法最常用的是激光法，原理是采用激光消除透明帶，對胚胎無直接影響，且可以靈活調節空洞大小，操作簡便。此外，兩種方法化學法和機械法由于對胚胎的不利影響大，目前的應用不多；活檢方法則包括抽吸法、機械切割法和激光切割法。抽吸法主要應用于卵裂球活檢，而對于囊胚活檢則需要在疝形成后使用激光法或機械切割法獲取滋養層細胞。