HPLC法測(cè)定芪貞增免顆粒、蛋雞寶中淫羊藿苷的含量

章安源，章安雯，張志民，陳 玲，李有志?

（1．山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250022；2．棗莊職業(yè)學(xué)院，山東棗莊277100）

淫羊藿是使用悠久的傳統(tǒng)中藥之一，其主要有效成分是黃酮類(lèi)化合物淫羊藿苷［1］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷具有多種生物活性［2］，并有抗缺氧、抗氧化等多種生物學(xué)功效［3-4］。淫羊藿來(lái)源于小檗科淫羊藿屬植物Epimedium L 干燥葉，以淫羊藿為主藥的制劑很多，如芪貞增免顆粒和蛋雞寶，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)僅用薄層和顯微鑒別淫羊藿苷［5］，淫羊藿藥材種類(lèi)多，鑒別困難。采收于夏秋的淫羊藿藥材地上部分花果已脫落，僅存葉片和葉柄，藥材中殘存一些花序軸和果梗，可作為補(bǔ)充特征，若藥材僅有葉片，可利用鑒別的特征就更少［6］。統(tǒng)計(jì)表明淫羊藿藥材各藥用部位中淫羊藿苷含量均為葉＞根＞莖［7］，中成藥在投料的過(guò)程中若投入淫羊藿莖及地下部分，僅靠當(dāng)前的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法難以鑒別［8］。未對(duì)含量進(jìn)行控制，不能全面反映制劑的質(zhì)量水平，達(dá)不到制劑治療效果。

本實(shí)驗(yàn)室首次應(yīng)用HPLC 對(duì)芪貞增免顆粒和蛋雞寶中淫羊藿苷進(jìn)行定量研究，方法快速、準(zhǔn)確。為控制本制劑的質(zhì)量提供標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀Waters e2695（配二極管陣列檢測(cè)器2998）；AE-240 電子天平（瑞士Mettlrer Toledo 公司）；KQ - 250DB 超聲儀（昆山市超聲儀有限公司）；

1．2 試藥與試劑 淫羊藿苷（批號(hào)：110737-201516，含量94．2%）；購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈（Merck，色譜純）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipso XDB-118 C18 柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：水［5］；流速：1 mL／min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫為30 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)范圍270 nm，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫表Tab 1 Gradient elution

2．2 溶液制備

2．2．1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取淫羊藿對(duì)照品適量，加甲醇配制成濃度為100 μg／mL 的對(duì)照品溶液。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 淫羊藿對(duì)照品溶液Fig 2 Control solution

2．2．2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 取適量2．2．1 項(xiàng)下溶液，用初始流動(dòng)相稀釋?zhuān)苽涑上盗袧舛葹?、10、25、50、100、200、250、400 μg／mL 標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2．2．3 供試品溶液制備 取樣品充分研磨，精密稱(chēng)取1．0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入40%甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，超聲（120 W，頻率40 kHz），超聲水浴溫度40 ℃，處理30 min，放冷，用40%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液后再次精密加入40%甲醇25 mL，合并兩次濾液后，0．22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得［5］。對(duì)照品與供試品出峰時(shí)間相一致。結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 芪貞増免顆粒Fig 3 Sample solution of Qizhenzengmian Granule

圖4 蛋雞寶Fig 4 Sample solution of Danjibao Powder

2．2．4 陰性樣品 取除淫羊藿的其它藥材適量，按樣品的制備工藝和配方比例制備陰性樣品，按2．2．3 項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液，即得。

2．2．5 陽(yáng)性添加樣品 精密稱(chēng)取已知含量的同批樣品（山東某獸藥生物有限公司提供）6 份，分別精密加入適量對(duì)照品，置于25 mL 容量瓶中，按2．2．3項(xiàng)下方法混合均勻制成陽(yáng)性添加樣品溶液。

2．3 方法線性考察 分別精密吸取2．2．2 項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μL，在2．1 項(xiàng)色譜條件下注入儀器，以峰面積為橫坐標(biāo)（X），濃度（μg）為縱坐標(biāo)（Y），回歸方程Y＝0．0004X-0．2941，R2＝0．9998；結(jié)果表明，淫羊藿苷在5～400 μg 與其對(duì)應(yīng)的峰面積有良好的線性關(guān)系。

2．4 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL 注入色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次。以峰面積計(jì)算，得出淫羊藿苷的RSD2．11%。表明儀器精密度良好，符合檢測(cè)要求。

2．5 重復(fù)性試驗(yàn) 同批供試品（批號(hào)為20180201，山東某獸藥生物科技有限公司提供），按2．2．3 項(xiàng)下制備6 份樣品溶液，分別注入液相色譜儀，計(jì)算淫羊藿苷含量，RSD為1．4%，說(shuō)明該方法重現(xiàn)性好，含量穩(wěn)定。

2．6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2．2．3 項(xiàng)下同一供試品溶液（批號(hào)：20180201），室溫下每隔4 h 連測(cè)6 次，進(jìn)樣體積20 μL，淫羊藿苷峰面積RSD分別為0．93%，0．89%、0．91%，表明本制劑在制備后的24 h 內(nèi)成份較穩(wěn)定。

2．7 回收率試驗(yàn) 取2．2．5 項(xiàng)下溶液2 mL，按2．1項(xiàng)下條件測(cè)定淫羊藿苷含量。回收率在92．02%～92．22%之間，變異系數(shù)在1．54%～1．88%之間，見(jiàn)表2-表3。表明該方法回收率較好，準(zhǔn)確度和精密度可以滿(mǎn)足檢測(cè)需求。

表2 芪貞增免顆粒中淫羊藿苷回收率試驗(yàn)（n=6）Tab 2 Recovery of icariin of Qizhenzengmian granule

表3 蛋雞寶中淫羊藿苷回收率試驗(yàn)（n=6）Tab 3 Recovery of icariin of Danjibao powder

2．8 樣品測(cè)定 精密稱(chēng)取不同企業(yè)芪貞増免顆粒，蛋雞寶樣品，按2．2．3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份樣品測(cè)定2 次，以2 次測(cè)定結(jié)果的平均值作為測(cè)定值，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果（n=6）Tab 4 The resultof the sample content

2．9 檢出限和定量限 取“2．2．4”項(xiàng)下溶液，色譜圖顯示無(wú)淫羊藿成分干擾，應(yīng)用本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法，添加對(duì)照品0．5 μg／mL，取與對(duì)照品圖譜中相同保留時(shí)間的噪音信號(hào)平均值，信噪比（S／N）≥3，確定為方法的檢出限。添加對(duì)照品10 μg／mL 顯示信噪比（S／N）≥10，作為此方法定量限。

3 討論與結(jié)論

3．1 供試品前處理提取方法的選擇 Jang 等以提取溶液濃度、提取溫度、溶液pH、液料比及提取時(shí)間為因素，發(fā)現(xiàn)在各因素中，提取溶液濃度及提取溫度是影響提取率的主要因素［9］。試驗(yàn)中著重考察以上條件因素。選擇6 種不同濃度提取溶劑：乙醇30%、40%、50%和30%、40%、50%甲醇［10-13］，結(jié)果表明40%甲醇溶解樣品不易結(jié)團(tuán)，溶解性最好且提取率最高，檢測(cè)樣品雜質(zhì)峰少。分別采用回流和超聲不同方式提取，超聲水浴溫度控制在20 ℃、30 ℃、40 ℃，并考察了不同的提取時(shí)間［14-17］。回流提取1 h 后和超聲提取30 min 淫羊藿苷即可提取完全，考慮到超聲提取更加簡(jiǎn)便、快速、故超聲處理30 min 來(lái)制備樣品。分別提取樣品2 次、3 次、4 次，超聲頻率40 kHz，水浴溫度控制在40 ℃，試驗(yàn)結(jié)果顯示提取2 次與3 次、4 次的淫羊藿苷含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為節(jié)約時(shí)間，提取2 次樣品即可滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求［18］。

3．2 流動(dòng)相的優(yōu)選 《中國(guó)獸藥典》2015 版二部中淫羊藿藥材含量測(cè)定使用流動(dòng)相是乙腈∶水（30 ∶70），但制劑中其它藥材對(duì)其分離度有影響，雜質(zhì)多，故比較以下5 種流動(dòng)相組進(jìn)行梯度洗脫：乙腈-水（25 ∶75）、乙腈-0．05%磷酸（27 ∶73）［15］、乙腈-水（50 ∶50）［16］，乙腈-水（28 ∶72）［17］、乙腈-水（23 ∶77）［19］。經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)使用乙腈-水（25 ∶75）梯度洗脫后淫羊藿苷峰分離度高，峰形對(duì)稱(chēng)，并無(wú)拖尾及其它雜質(zhì)峰的干擾。使用其他流動(dòng)相顯示淫羊藿苷多在30 min 后出峰，出峰時(shí)間晚，此方法測(cè)定供試品方法穩(wěn)定，準(zhǔn)確度高，且節(jié)約時(shí)間。

3．2 色譜柱的選擇 使用不同型號(hào)的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱進(jìn)行比較，HypersilBDS-C18（250 mm×4．6 mm，5 μm）［15］，Cosmosil C18（250 mm×4．6 mm，5 um）［18］、Agilent Eclipso XDB-118 C18 柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）進(jìn)行比較，后者普通C18柱即可滿(mǎn)足淫羊藿苷測(cè)定方法的重復(fù)性需求，結(jié)果表明方法實(shí)用性及耐用性良好。

3．3 柱溫的確定 25 ℃和30 ℃、35 ℃柱溫進(jìn)行考察，30 ℃柱溫時(shí)，基線平穩(wěn)，柱壓穩(wěn)定，對(duì)照品出峰時(shí)間與樣品時(shí)間一致，選擇30 ℃柱溫符合檢測(cè)要求。

3．4 影響淫羊藿苷含量測(cè)定的因素 淫羊藿苷含量測(cè)定結(jié)果表明來(lái)自于不同廠家芪貞增免顆粒和蛋雞寶含量差別較大，分析可能是不同產(chǎn)地淫羊藿藥材中淫羊藿苷的含量有差異［13］，也可能與藥材貯存有關(guān)［2］，其次或于顆粒劑與散劑不同的工藝制備過(guò)程中對(duì)藥物中有效成分有影響。

3．5 結(jié)論 采用現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中簡(jiǎn)單的顯微鑒別特征和薄層色譜難以控制制劑和藥效的穩(wěn)定性，難確保臨床療效。應(yīng)完善制劑中淫羊藿苷含量質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)處理簡(jiǎn)捷，快速，方法可靠，重現(xiàn)性及回收率均符合要求，適合測(cè)定淫羊藿苷的含量，可有效控制芪貞增免顆粒、蛋雞寶等方劑的內(nèi)在質(zhì)量。今后還需結(jié)合大生產(chǎn)繼續(xù)積累數(shù)據(jù)，考察產(chǎn)品的穩(wěn)定性。也有研究認(rèn)為以多指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)淫羊藿質(zhì)量更為科學(xué)［13，15］。