柴黃口服液對(duì)靶動(dòng)物雞安全性試驗(yàn)研究

劉 毅張國(guó)榮耿智霞賈 興瞿紅穎劉 欣?宋婷婷劉 靜魏麗娟劉 欣史萬(wàn)玉

（1．河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，石家莊050041；2．河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，石家莊050041；3．黃驊市農(nóng)業(yè)局，滄州061100；4．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定071001）

我國(guó)大部分地區(qū)每年夏季都會(huì)出現(xiàn)持續(xù)性高溫、高濕天氣，如果外界環(huán)境溫、濕度過(guò)高，特別是通風(fēng)不良等，雞體散熱困難，體內(nèi)新陳代謝和生理機(jī)能紊亂，嚴(yán)重影響到雞的采食量、生產(chǎn)繁殖性能、飼料利用率以及產(chǎn)品質(zhì)量下降，并可導(dǎo)致雞在短時(shí)間內(nèi)大量死亡。長(zhǎng)期以來(lái)，高溫、高濕給畜禽業(yè)帶來(lái)不可忽視的經(jīng)濟(jì)損失［1-3］，因此，如何有效的緩解由高溫、高濕引起的疾病，已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者們的高度重視，而進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和研究能夠緩解或修復(fù)動(dòng)物由高溫、高濕引起的疾病損傷的安全型藥物將對(duì)畜禽生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

柴黃口服液由柴胡、黃芩兩味藥材提取組成，具有清熱燥濕的作用，擬臨床用于預(yù)防高溫、高濕引起的雞群發(fā)熱，精神不振，食欲下降。為了全面評(píng)價(jià)本制劑在臨床上使用的安全性，研究根據(jù)《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》［4］，通過(guò)靶動(dòng)物安全試考察其用于靶動(dòng)物雞的的安全性及安全劑量范圍，為臨床試驗(yàn)給藥方案的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼料 1日齡體重相差±5 g 的羅斯308 肉雛雞：購(gòu)自河北大午農(nóng)牧集團(tuán)種禽公司，嚴(yán)格按照管理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)。

飼料：購(gòu)自河北大午農(nóng)牧集團(tuán)生產(chǎn)的雛雞全價(jià)飼料。

1．1．2 供試藥品及試劑 柴黃口服液：河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司生（含量：每1 mL 相當(dāng)于原生藥1 g，批號(hào)：150312）。

門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒、尿素氮試劑盒、肌酐試劑盒購(gòu)于北京北化康泰臨床試劑有限公司。

1．1．3 儀器設(shè)備 TBA-120FR 全自動(dòng)生化分析儀（日本東芝）；08-230-2C 型滑走切片機(jī)（日本愛(ài)爾瑪公司）；S-35 型羽毛刀片（日本愛(ài)爾瑪公司）。

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物分組與處理 根據(jù)《獸用中藥、天然藥物臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》中對(duì)靶動(dòng)物安全試驗(yàn)的分組要求，從新購(gòu)進(jìn)的1日齡體重相差±5 g 的羅斯308 肉雛雞中選取健康活潑的雛雞80 只，隨機(jī)分為四組，每組20 只。其中1～3 組為試驗(yàn)組，分別在飲水中全程添加擬推薦劑量（1 mL／L）1 倍、3 倍和5倍的柴黃口服液；4 組為不用藥對(duì)照組，全程飲用新鮮自來(lái)水。試驗(yàn)期6 周，每天觀察并記錄各組雞的臨床體征，每周末稱重1 次，6 周末試驗(yàn)結(jié)束時(shí)心臟采血，用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀測(cè)定白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量測(cè)定各組雞的血液學(xué)指標(biāo)，分離血清，用門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒、尿素氮試劑盒和肌酐試劑盒測(cè)定AST、ALT、BUN 和CRE 等血液生化指標(biāo)。同時(shí)進(jìn)行剖檢，觀察各臟器有無(wú)眼觀和顯微結(jié)構(gòu)上的變化。

1．2．2 檢測(cè)指標(biāo)及方法 臨床體征變化觀察：試驗(yàn)過(guò)程中，每天觀察并記錄各組雞的臨床體征，比較各組雞群之間有無(wú)異常變化。

體重測(cè)定：試驗(yàn)過(guò)程中，每周末測(cè)定各組雞的體重變化情況，比較各組雞群之間的體重有無(wú)異常變化。

血液生理指標(biāo)的測(cè)定：6 周末試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組雞心臟采血，測(cè)定各組雞的血液生理指標(biāo)的變化情況。

①紅細(xì)胞總數(shù)的測(cè)定 采用試管法，即將供檢血稀釋200 倍后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)一定容積內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)，最后計(jì)算出每升血液中的紅細(xì)胞數(shù)。紅細(xì)胞總數(shù)的計(jì)算公式：紅細(xì)胞總數(shù)（×1012個(gè)／L）＝X／100×1012。式中的X為5 個(gè)中方格的紅細(xì)胞總數(shù)。

②白細(xì)胞總數(shù)的測(cè)定 采用試管法，即將供檢血稀釋20 倍后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)一定容積內(nèi)的白細(xì)胞數(shù)，最后計(jì)算出每升血液中的白細(xì)胞數(shù)。白細(xì)胞總數(shù)的計(jì)算公式：白細(xì)胞總數(shù)（×109個(gè)／L）＝X×50×106。式中的X為4個(gè)大方格中的白細(xì)胞總數(shù)。

③血紅蛋白含量的測(cè)定 采用比色法。紅細(xì)胞遇酸溶解后會(huì)游離出血紅蛋白，并被酸化為褐色的酸性血紅素，稀釋后與標(biāo)準(zhǔn)比色柱比色，即可求得血紅蛋白的含量。

④淋巴細(xì)胞比例的測(cè)定 用未抗凝血，制作血涂片，姬姆薩染色法染色，采用白細(xì)胞胞分類法對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算淋巴細(xì)胞比例。

血液生化指標(biāo)的測(cè)定：試驗(yàn)組在飲水中以推薦劑量的1 倍、3 倍、5 倍劑量加入柴黃口服液飲喂雛雞，對(duì)照組正常飲水，6 周后，剖殺取血液制備血清，測(cè)定肝功能指標(biāo)門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和腎臟功能指標(biāo)尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）。

剖檢變化觀察：6 周末試驗(yàn)結(jié)束后，將各組雞進(jìn)行剖檢，觀察其眼觀剖檢變化。

組織切片觀察：取肝臟、腎臟、脾臟、心臟固定，石蠟切片，H-E 染色并觀察。

1．3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì) 應(yīng)用SPSS17．0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 臨床表現(xiàn) 在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，1 倍、3 倍、5倍劑量試驗(yàn)組和對(duì)照組的雛雞，活潑好動(dòng)，能自由攝食、飲水，糞便正常。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程所有雛雞均存活，未出現(xiàn)中毒性臨床癥狀。

2．2 體重變化 由表1可知，肉雞在試驗(yàn)期前3 周內(nèi)各組間的平均體重均無(wú)顯著性差異（P＞0．05）。只是在42日齡試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，1 倍劑量組和3 倍劑量組肉雞的體重均顯著高于5 倍劑量組和不用藥對(duì)照組（P＜0．05）；而1 倍劑量組和3 倍劑量組間，以及5 倍劑量組和對(duì)照組間均無(wú)顯著性差異（P＞0．05） 。

表1 試驗(yàn)各組體重情況（ ±SD） （g／只）Tab 1 Weight of each group in the trial（ ±SD）

2．3 血液生理指標(biāo)變化 由表2可知，各試驗(yàn)組與對(duì)照組的紅細(xì)胞總數(shù)，血紅蛋白含量、白細(xì)胞總數(shù)均差異不顯著（P＞0．05），各試驗(yàn)組之間的淋巴細(xì)胞比例也均無(wú)顯著差異（P＞0．05）。

表2 各組雛雞血液生理指標(biāo)（ ±SD）Tab 2 Blood physiological indexes of chickens in each group

2．4 血液生化指標(biāo)變化情況 由表3可知，試驗(yàn)組雛雞血清中門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）的含量均與對(duì)照組差異不顯著（P＞0．05 ），且各試驗(yàn)組各劑量水平之間差異也不顯著（P＞0．05）。

表3 對(duì)血液生化指標(biāo)的影響（ ±SD）Tab 3 The influence on blood biochemical indexes

2．5 大體剖檢變化 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)各組雛雞進(jìn)行剖檢觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組雞的臟器顏色，形狀，大小、位置等均未見(jiàn)異常變化。

2．6 主要臟器病理組織切片觀察 在進(jìn)行上述剖檢檢查時(shí)，采集各組雞的心、肝、脾、腎等實(shí)質(zhì)器官，制作石蠟切片，進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)的顯微觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組織器官的細(xì)胞輪廓完整，排列有序；胞質(zhì)豐滿，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，符合正常組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，說(shuō)明柴黃口服液對(duì)所采集組織無(wú)毒性作用（圖1～圖4）。

圖1 肝臟組織切片顯微結(jié)構(gòu)Fig 1 Microstructure of liver tissue slices

圖2 脾臟組織切片顯微結(jié)構(gòu)Fig 2 Microstructure of splenic tissue section

圖3 脾臟組織切片顯微結(jié)構(gòu)Fig 3 Microstructure of splenic tissue section

圖4 心臟組織切片顯微結(jié)構(gòu)Fig 4 Microstructure of cardiac tissue slices

3 討論與結(jié)論

中獸醫(yī)學(xué)認(rèn)為，雞群長(zhǎng)時(shí)間處于高溫、高濕的環(huán)境中，熱邪極易侵襲機(jī)體，引起機(jī)體發(fā)熱。柴黃口服液由柴胡和黃芩配伍組成，方中柴胡可瀉半表半里之表熱［5］，黃芩可瀉半表半里之里熱［6-7］；柴胡升清陽(yáng)，黃芩降濁火。二藥相合，升清降濁，調(diào)和表里，和解少陽(yáng)，清少陽(yáng)之邪熱。柴胡又長(zhǎng)于開(kāi)郁，黃芩又善于泄熱。兩藥相互為用，既可調(diào)肝膽之氣機(jī)，又可清泄內(nèi)蘊(yùn)之熱邪［8-10］。

靶動(dòng)物安全性試驗(yàn)是觀察不同劑量受試獸藥作用于靶動(dòng)物后從有效作用到毒性作用，甚至到致死作用的動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程。該試驗(yàn)旨在考察受試獸藥使用于靶動(dòng)物的安全性及安全劑量范圍，為進(jìn)一步臨床試驗(yàn)給藥方案的制定提供依據(jù)。為觀察不同劑量柴黃口服液作用于靶動(dòng)物后從有效作用到毒性作用的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，而進(jìn)行了本次試驗(yàn)。采用與臨床應(yīng)用相同的給藥途徑，給藥為全程給藥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：柴黃口服液三個(gè)劑量組雛雞狀態(tài)良好，生長(zhǎng)正常，未出現(xiàn)中毒癥狀及死亡，血液生化生理指標(biāo)、剖檢以及組織顯微結(jié)構(gòu)等與對(duì)照組相比均無(wú)明顯差異。只是在42日齡試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，1 倍劑量組和3 倍劑量組肉雞的體重均顯著高于5 倍劑量組和不用藥對(duì)照組（P＜0．05），這種變化并非受試藥物柴黃口服液的毒副作用，可能與柴黃口服液能夠清解雛雞脾胃濕熱，進(jìn)一步調(diào)動(dòng)脾胃功能，提高雛雞采食、消化和吸收有關(guān)。而5 倍劑量組卻并未提高雛雞的體重，可能與藥物濃度太高，超過(guò)柴黃口服液有效藥物濃度范圍有關(guān)。因此，柴黃口服液按照1 倍（1mL／L）、3 倍（3mL／L）、5 倍（5mL／L）推薦劑量，分別連續(xù)飲水給藥42 d，均對(duì)靶動(dòng)物雞無(wú)明顯毒副作用。因此，柴黃口服液在臨床上以1mL／L在雞飲水中混飲是安全的。