HPLC-PDA法測(cè)定恩諾沙星注射液中非法添加乙酰甲喹和水楊酸

薄永恒，李淑煥，李有志?，馮 濤，徐紅瑋，張 琦

（1．山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所／山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250022；2．山東省農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南250100）

恩諾沙星注射液收載于《中國(guó)獸藥典》2015 版第一部［1］，為廣譜殺菌藥，對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等都有殺菌效用，主要治療由此病菌引起的消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病。乙酰甲喹商品名稱為痢菌凈［2］，獸醫(yī)臨床主要用于禽巴氏桿菌病、雛雞白痢等。水楊酸屬于非甾體抗炎藥，常用于緩解家畜的發(fā)燒、感冒時(shí)的體溫升高及關(guān)節(jié)疼痛等癥狀［3］。當(dāng)前，某些不法獸藥生產(chǎn)企業(yè)為了擴(kuò)大恩諾沙星藥物的療效，而隱蔽乙酰甲喹和水楊酸的使用，在恩諾沙星注射液中添加乙酰甲喹和水楊酸的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，造成乙酰甲喹和水楊酸的混亂使用，且不能執(zhí)行其休藥期，最終造成動(dòng)物性食品中殘留乙酰甲喹和水楊酸的嚴(yán)重后果。目前，關(guān)于乙酰甲喹和水楊酸的含量檢測(cè)方法的報(bào)道較多，主要包括紫外可見(jiàn)分光光度法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。由于獸藥制劑之間的檢測(cè)方法差距較大，檢測(cè)量上不在同一個(gè)級(jí)別，而且藥物成分之間存在相互干擾［4］，因此，急需開(kāi)發(fā)一種同時(shí)檢測(cè)恩諾沙星、乙酰甲喹和水楊酸的的方法，用以檢測(cè)恩諾沙星注射液中乙酰甲喹和水楊酸的存在。為利于地市縣等獸藥檢驗(yàn)部門(mén)開(kāi)展獸藥非法添加的檢驗(yàn)工作，本研究將建立科學(xué)、有效、簡(jiǎn)單的恩諾沙星注射液中非法添加乙酰甲喹和水楊酸的檢測(cè)技術(shù)，以有效杜絕非法添加的問(wèn)題。

1 材 料

1．1 儀器 Waters 2695e 高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Waters 公司；XS-205 電子天平，瑞士Mettler Toledo 公司。

1．2 試劑與材料 甲醇、乙腈為色譜純，Merck KGaA 公司，其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q超純水。乙酰甲喹對(duì)照品（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0401204，含量：99．6%）；恩諾沙星（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0081505，含量：99．5%）；水楊酸（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130451-201203，含量：84．2%）。

2 方 法

2．1 色譜條件 色譜柱：Waters XBridge C18 色譜柱，（4．6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0．025 moL／L磷酸溶液∶乙腈＝85 ∶15（V∶V）；流速1．0 mL／min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25 ℃；二極管陣列檢測(cè)器參考條件：定性采集波長(zhǎng)范圍200～400 nm；定量波長(zhǎng)232 nm。

2．2 溶液的制備

2．2．1 供試品溶液 量取恩諾沙星注射液0．5 mL，置50 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL 置50 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2．2．2 對(duì)照品溶液 稱乙酰甲喹、水楊酸對(duì)照品50 mg（準(zhǔn)確至0．01 mg），置50 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取1 mL 置100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品工作液。

2．2．3 系統(tǒng)適應(yīng)性溶液 分別精密量取乙酰甲喹、水楊酸對(duì)照品儲(chǔ)備液100 μL 和200 μL，置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋并定容至刻度，即得。

2．2．4 陰性添加溶液 分別精密量取乙酰甲喹、水楊酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置10 mL 量瓶中，用陰性無(wú)添加的恩諾沙星注射液的供試品溶液稀釋并定容至刻度。

2．3 方法學(xué)考察

2．3．1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 乙酰甲喹、水楊酸在試驗(yàn)條件下完全分離，分離度均大于1．5，各化合物的色譜峰理論塔板數(shù)均大于5000，方法專(zhuān)屬性良好。系統(tǒng)適應(yīng)性溶液色譜圖（圖1）及相應(yīng)對(duì)照品光譜圖（圖2）。

圖1 水楊酸（濃度20μg／mL）、乙酰甲喹（濃度10μg／mL）色譜圖Fig 1 Chromatogram of salicylic acid （20μg／mL） and acetoquine （10μg／mL）

圖2 乙酰甲喹、水楊酸光譜圖Fig 2 Spectrum of acetoquine and salicylic acid

2．3．2 線性范圍 精密稱乙酰甲喹、水楊酸對(duì)照品50 mg（準(zhǔn)確至0．01 mg），置50 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。用流動(dòng)相分別配制水楊酸、乙酰甲喹的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5 種，濃度分別為50、20 μg／mL、20、10 μg／mL、10、5 μg／mL、2、1 μg／mL、1、0．5 μg／mL。從低濃度到高濃度一次注入液相色譜儀測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，水楊酸、乙酰甲喹標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程分別為：y＝35628．467x-4908．954、y＝58342．897x+2297．349，相關(guān)系數(shù)R2分別為1．000、1．000。結(jié)果表明在線性范圍內(nèi)，水楊酸、乙酰甲喹濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2．3．3 峰純度檢查 對(duì)陰性空白添加樣品的光譜圖中兩個(gè)目標(biāo)化合物進(jìn)行峰純度檢查，結(jié)果見(jiàn)圖4～圖5和表1。結(jié)果顯示，陰性空白在232 nm處有吸收值，但與兩個(gè)目標(biāo)化合物有較大分離，分離度大于1．5，達(dá)到很好的分離，如圖3，且各色譜峰的純度角度均小于純度閾值，表明此色譜條件下，兩個(gè)目標(biāo)化合物的出峰位置無(wú)其他干擾峰，為單一物質(zhì)，方法可行。

圖3 水楊酸（濃度20 μg／mL）、乙酰甲喹（濃度10 μg／mL）的陰性添加溶液色譜圖Fig 3 Chromatogram of salicylic acid （20 μg／mL） and acetoquine （10 μg／mL） in negative addition solution

圖4 陰性空白添加水楊酸的純度圖Fig 4 Purity diagram of the addition of salicylic acid to the negative blank

圖5 陰性空白添加乙酰甲喹的純度圖Fig 5 Purity map of acetaminoquin added to negative blank

表1 峰純度檢查結(jié)果表Tab 1 Peak Purity Check Results Table

2．3．4 靈敏度試驗(yàn) 在陰性樣品中添加乙酰甲喹、水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，獲得0．5 μg／mL 和0．25 μg／mL 的添加乙酰甲喹終濃度樣品和1 μg／mL 和0．5 μg／mL的添加水楊酸終濃度樣品，進(jìn)行檢測(cè)，以光譜圖失真的最大濃度作為方法的檢出限［5］。水楊酸在0．5 μg／mL的添加終濃度下，光譜圖已失真，如圖6，因此，水楊酸的最低檢出限濃度為1 μg／mL，在恩諾沙星注射液中的檢出限為0．5 mg／mL；乙酰甲喹在0．25 μg／mL 的添加終濃度下，光譜圖已失真，如圖7，因此，乙酰甲喹的最低檢出限濃度為0．5 μg／mL，在恩諾沙星注射液中的檢出限為0．25 mg／mL。

圖6 水楊酸的檢出限光譜圖（0．5mg／mL）Fig 6 Spectral map of salicylic acid detection limit （0．5mg／mL）

圖7 乙酰甲喹的檢出限光譜圖（0．25mg／mL）Fig 7 Spectral map of detection limit of acetoquine （0．25mg／mL）

2．3．5 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn) 取制得的陰性空白溶液，分別加入適量的1 mg／mL 的水楊酸和乙酰甲喹標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，制成高添加濃度樣品（水楊酸20 μg／mL，乙酰甲喹10 μg／mL），中添加濃度樣品（水楊酸10 μg／mL，乙酰甲喹5 μg／mL），低添加濃度樣品（水楊酸2 μg／mL，乙酰甲喹1μg／mL）。每個(gè)濃度三份平行樣品。計(jì)算回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示水楊酸平均回收率為99．51%；乙酰甲喹平均回收率為99．62%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在0．07%～3．44%之間，結(jié)果見(jiàn)表2～表3。

表2 恩諾沙星注射液中乙酰甲喹添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Experimental results of recovery of acetoquine in enrofloxacin injection

表3 恩諾沙星注射液中水楊酸添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Experimental results of salicylic acid addition recovery rate in enrofloxacin injection

續(xù)表

2．3．6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一陰性添加溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰面積，乙酰甲喹、水楊酸峰面積的RSD均小于0．4%。結(jié)果表明供試品溶液在室溫下放置24 h 穩(wěn)定。

2．3．7 耐用性 從柱溫及色譜柱兩個(gè)方面考察方法的耐用性。改變柱溫為20、25、30、40 ℃，出峰順序無(wú)變化，保留時(shí)間稍有變化。使用不同品牌、不同型號(hào)的色譜柱，例如，Thermp HypersiL GoLd（4．6×250 mm，5 μm）；Waters XBridge C18（4．6×150 mm，5 μm）；Waters XBridge C18（3．5×150 mm，5μm）等，結(jié)果3 種成份仍能很好的分離且出峰時(shí)間理想。最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇中流速的變化對(duì)3 種成份的影響也不大，本方法的耐用性良好。

3 討論與結(jié)論

3．1 流動(dòng)相選擇 根據(jù)《中國(guó)獸藥典》2015 版第一部恩諾沙星注射液的含量測(cè)定方法，設(shè)定了流動(dòng)相0．025 moL／L 磷酸溶液∶乙腈的比例，分別為83 ∶17，85 ∶15，90 ∶10，結(jié)果顯示在流動(dòng)相0．025 moL／L 磷酸溶液∶乙腈體積比為85 ∶15 時(shí)，恩諾沙星、乙酰甲喹、水楊酸的分離度符合分離的要求，因此，選擇0．025 moL／L 磷酸溶液∶乙腈（85 ∶15）為流動(dòng)相。

3．2 吸光度選擇 由于在乙酰甲喹最大吸收值時(shí)，水楊酸的的吸收度較低，在水楊酸的最大吸收值232 nm 作為定量波長(zhǎng)時(shí)，乙酰甲喹也有較大吸收，以便獲得最準(zhǔn)確的吸收值，因此，選擇232 nm作為方法的吸收波長(zhǎng)。

3．3 光譜圖的處理 作為定性的最主要圖譜，對(duì)陰性空白添加樣品的光譜圖中兩個(gè)目標(biāo)化合物進(jìn)行峰純度檢查，當(dāng)純度角度小于純度閾值時(shí)，判定為此出峰物質(zhì)為單一物質(zhì)，同時(shí)與標(biāo)品光譜圖比對(duì)出峰時(shí)間一致時(shí)，判定為此物質(zhì)為對(duì)應(yīng)出峰時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加，以此為添加物定性標(biāo)準(zhǔn)。

本方法采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了恩諾沙星注射液中添加乙酰甲喹、水楊酸的定性定量檢測(cè)。同時(shí)可以通過(guò)峰純度檢查鎖定非法添加物，通過(guò)保留時(shí)間與對(duì)照品進(jìn)行對(duì)比，實(shí)現(xiàn)了恩諾沙星注射液中非法添加物的高效、快速、準(zhǔn)確識(shí)別，成功建立了恩諾沙星注射液中添加乙酰甲喹、水楊酸的測(cè)定——高效液相色譜法。本方法乙酰甲喹檢出限為0．25 mg／mL、水楊酸檢出限為0．5 mg／mL。