超高效液相色譜-紫外檢測法測定腎復康合劑中落新婦苷和蘆丁的含量

魏秀麗丁新仁徐恩民?欒明娜李有志孫亞磊張傳津

（1．山東省獸藥質量檢驗所，濟南250022；2．山東省畜產品質量安全監測與風險評估重點實驗室，濟南250022；3．山東齊發藥業有限公司，濟南250400；4．青島蔚藍生物股份有限公司，山東青島266000）

腎復康合劑由土茯苓、槐花、白茅根、益母草、廣藿香等中藥經提取加工所制成的口服液體制劑，本處方來源于中華人民共和國藥典2015年版一部“腎復康膠囊”，具有清熱利尿、益腎化濁的功能［1］。經過提取工藝參數的優化、藥學藥效、靶動物雞安全性及穩定性試驗等的研究，開發成一種新獸藥合劑，主成分土茯苓具有解毒除濕通利關節的作用，槐花具有涼血止血之妙，在中獸醫臨床上用于防治由雞大腸桿菌病、雞傳染性法氏囊病、雞傳染性支氣管炎、雞病毒性腎炎或中毒、營養代謝障礙等引起的雞腎腫濕熱證，經臨床試驗證實在靶動物雞上兌水飲用［2］，安全有效經濟方便。以往常常采用普通高效液相色譜方法檢測土茯苓和槐花主成分中落新婦苷和蘆丁的含量［3-6］，時間長，檢測結果慢。本實驗開發了超高效液相色譜-紫外檢測法測定腎復康合劑中落新婦苷和蘆丁的含量，快速可行，經濟環保。

1 材料與方法

1．1 藥品及試劑 落新婦苷（批號111574-201404，20 mg，中國食品藥品檢定研究院）；蘆丁（批號111868-201401，20 mg，中國食品藥品檢定研究院）。甲酸、甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；超純水。腎復康合劑，批號20150601，青島蔚藍生物股份有限公司小試生產產品。

1．2 儀器 分析天平：感量0．00001 g；儀器Waters AcquityTM Ultra performance LC 超高效液相色譜儀；Aglient1260 高效液相色譜儀。

1．3 方法

1．3．1 供試品溶液制備 精密量取本品0．5～1．0 mL，加60%甲醇稀釋至50 mL，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

1．3．2 標準儲備液的制備 精密稱取落新婦苷10．03 mg，加60%甲醇至10 mL，精密稱取蘆丁9．98 mg，加60%甲醇至10 mL。

1．3．3 標準工作液的制備 取適量標準儲備液，用60%甲醇稀釋，制備成系列濃度為：落新婦苷2、5、10、25、50、75 μg／mL，蘆丁4、10、20、50、100、150 μg／mL標準工作液，繪制標準曲線。

1．3．4 色譜操作條件及參數 色譜柱：ACQUITY UPLCTM C18 色譜柱（2．1mm×100 mm，1．7 μm）；流動相A：乙腈；流動相B：0．1%甲酸溶液，進行梯度洗脫；流速：0．35 mL／min；進樣量：5 μL；柱溫：35 ℃，進樣室溫度10 ℃。二極管陣列檢測器，檢測波長為204 nm。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件表Tab 1 Table of gradient eluting conditions

1．3．5 重復性試驗和精密度試驗 配制50 μg／mL落新婦苷100 μg／mL 蘆丁對照品溶液，重復配置6 份，進樣，計算落新婦苷、蘆丁峰面積RSD。配制50 μg／mL 落新婦苷100 μg／mL 蘆丁對照品溶液，重復進樣6 次，計算落新婦苷、蘆丁峰面積RSD。

1．3．6 檢測限和定量限的測定 對落新婦苷和蘆丁的標準工作液，進行UPLC 的分析，并逐級降低其濃度，以溶液檢測時的信噪比（S／N）分別大于等于3 和10 作為藥物的檢測限和定量限。

1．3．7 不同色譜條件樣品檢測比較 使用普通的液相色譜儀和超高效液相色譜儀在不同的色譜條件下運行，對同一合劑樣品中兩主成分落新婦苷和蘆丁的含量、檢測波長和出峰時間分別進行比較。

1．3．8 穩定性試驗 進樣室溫度設置到10 ℃。取1．3．5 項下50 μg／mL 落新婦苷100 μg／mL 蘆丁溶液，在10 ℃放置3、6、12、24 h；各進樣2 μL，計算落新婦苷、蘆丁峰面積RSD。

1．3．9 回收率的測定 精密稱定已知含量（原有量）的同一批合劑樣品0．5 mL 共6 份，加入落新婦苷儲備液1．0 mL 和蘆丁儲備溶液2．5 mL，按供試品溶液制備方法分別制備供試品溶液50 mL，進樣，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，計算落新婦苷和蘆丁的回收率和RSD。

1．3．10 色譜柱耐受性 本實驗選擇了35 ℃流速0．34、0．35、0．36 mL／min 測試色譜柱保留時間的耐受性。并選擇流速0．35 mL／min 保持不變，柱溫35、38、40 ℃進樣，測試色譜柱的耐受性。

2 結果與分析

2．1 色譜分離 在優化的色譜條件下，測得落新婦苷和蘆丁色譜峰峰形良好，且均達到基線分離，滿足分離度要求。

2．2 線性 在選定的色譜條件下，使用梯度洗脫的方法，可以有效地分離目的峰，落新婦苷在2～75 μg／mL 的范圍內標準曲線方程為y＝88300x+77000，Y為落新婦苷峰面積，X為落新婦苷的濃度，其相關系數R2大于0．998，線性良好；蘆丁在4～150 μg／mL 的范 圍 內 標準 曲 線 為y＝43800x+126000，Y為蘆丁峰面積，X為蘆丁的濃度，其相關系數R2大于0．996，線性良好。

2．3 重復性試驗和精密度試驗 配制50 μg／mL落新婦苷100 μg／mL 蘆丁對照品溶液，重復6 份，進樣，計算落新婦苷、蘆丁峰面積RSD分別為0．63%、0．59%，滿足實驗要求。取50 μg／mL 落新婦苷100 μg／mL 蘆丁對照品溶液，重復進樣6 次，計算落新婦苷、蘆丁峰面積RSD為0．23%、0．26%，滿足實驗要求。

2．4 檢測限和定量限 1 μg／mL 落新婦苷2 μg／mL蘆丁對照品溶液信噪比＞3 為檢出限，2 μg／mL 落新婦苷4 μg／mL 蘆丁對照品溶液信噪比＞10 為定量限。

2．5 不同色譜條件樣品檢測結果比較 對同一合劑樣品中兩主成分落新婦苷和蘆丁的含量、檢測波長和出峰時間分別進行了比較，結果如表2所示。

表2 不同色譜條件檢測結果表（n=6）Tab 2 Test results at different chromatographic parameter （n=6）

高效液相色譜運行條件按照中華人民共和國藥典方法進行［1］。由于兩種色譜方法均已通過其方法學驗證，均可以準確控制其指標成分。從檢測效率上看，優選超高效法（UPLC）色譜圖見圖1～圖2。普通色譜法采用了雙波長檢測落新婦苷和蘆丁的含量，色譜圖見圖3～圖4。

2．6 穩定性試驗 落新婦苷、蘆丁峰面積RSD為0．47%、0．58%，滿足實驗要求。

2．7 加樣回收試驗結果 落新婦苷和蘆丁的平均回收率為98．33%和97．14%，RSD分別為0．88%和1．18% （表3～表4）。

圖1 75 μg／mL 落新婦苷150 μg／mL 蘆丁對照品溶液色譜圖（204 nm）Fig 1 Chromatogram of reference solution of 75μg／mL astilbin and 150μg／mL rutin at 204 nm

圖2 腎復康合劑樣品色譜圖204 nmFig 2 chromatogram of Shenfukang mixture sample at 204 nm

圖3 高效液相色譜法 對照品色譜圖Fig 3 chromatogram of reference standard by HPLC

圖4 高效液相色譜法 腎復康合劑色譜圖Fig 4 Chromatogram of Shenfukang mixture by HPLC

表3 落新婦苷加樣回收率試驗結果Tab 3 Test results of recovery rate of astilbin

表4 蘆丁加樣回收率試驗結果Tab 4 test results of Recovery of rutin

2．8 色譜柱耐受性 本實驗選擇了35 ℃流速0．34、0．35、0．36 mL／min 進行進樣測試，保留時間如表5所示，流動相流速的微小變化對保留時間影響不大，最終選擇0．35 mL／min。

本實驗選擇流速0．35 mL／min 保持不變，35、38、40 ℃下進樣測試，保留時間如表6所示，分離度均滿足要求。考慮到色譜柱的耐受性，最終選擇35 ℃。

表5 不同流速主成分保留時間表Tab 5 Retention time of principal components at different flow rate

表6 不同柱溫主成分保留時間表Tab 6 Retention time of principal components at different column temperatures

3 討論與結論

3．1 檢測波長的選擇 蘆丁、落新婦苷對照品和腎復康合劑樣品待測液，在2．1 項條件下，色譜保留時間為4．884、5．760 min 左右，分離度均滿足要求（圖1～圖2、圖5～圖8）。光譜圖如圖9所示。由色譜圖和光譜圖可以看出對照品和樣品中，257 nm落新婦苷響應值很低，291 nm 蘆丁響應值較低，定量波長為顧及兩者相應值都高，定為204 nm（204 nm 基線噪音干擾并不明顯），峰面積見表7。

波長選擇方面，比較了204、291、257 nm 三個波長下落新婦苷和蘆丁的峰面積，考慮到兩種目標產物的檢測，本方法最終選擇了波長204 nm，光譜圖亦提示在這一波長處兩種成分均有較大吸收，因此，檢測波長由藥典上的雙波長簡化為單波長。

圖5 75 μg／mL 落新婦苷150 μg／mL 蘆丁對照品溶液色譜圖（257 nm）Fig 5 Chromatogram of reference solution of 75 μg／mL astilbin and 150μg／mL rutin at 257 nm

圖6 75 μg／mL 落新婦苷150 μg／mL 蘆丁對照品溶液色譜圖（291 nm）Fig 6 Chromatogram of reference solution of 75 μg／mL astilbin and 150μg／mL rutin at 291 nm

圖7 腎復康合劑樣品色譜圖（出峰順序：蘆丁、落新婦苷）257 nmFig 7 Chromatogram of Shenfukang Mixture（peak sequence：rutin，astilbin） at 257 nm

圖8 腎復康合劑樣品色譜圖（出峰順序：蘆丁、落新婦苷）291 nmFig 8 Chromatogram of Shenfukang Mixture（peak sequence：rutin，astilbin） at 291 nm

圖9 75 μg／mL 落新婦苷150 μg／mL 蘆丁對照品溶液光譜圖Fig 9 Spectrogram of reference solution of 75μg／mL astilbin and 150μg／mL rutin

表7 與藥典規定波長下比較相應峰面積表Tab 7 comparison of peak response at the wavelength specified in Pharmacopoeia

3．2 流動相的選擇 在色譜條件流動相的選擇上，分別考察了有機相甲醇和乙腈及找到各自適合的比例，發現同一樣品采用乙腈洗脫相比甲醇，色譜圖中目標峰響應信號相對低一點，但根據兩種溶劑的截止波長甲醇205 nm 和乙腈190 nm，因此，最終選擇了乙腈-0．1%甲酸系統。

本實驗選擇了超高效液相色譜-紫外檢測法對腎復康合劑中落新婦苷和蘆丁進行定性和定量測定。與普通高效液相色譜方法相比，鑒別增加了光譜法；二是定量的色譜圖出峰保留時間在5 min 左右，每針運行時間10 min 足夠，流速0．35 mL／min；而普通液相每針運行35 min，流速1．0 mL／min；超高效液相色譜方法比普通高效液相色譜方法運行時間縮短25 min，每運行一針流動相節省31．5 mL。在廢液處理高成本的今天，超高效液相色譜方法更有優勢，更經濟和快捷。

綜上所述，使用超高效液相色譜法，對腎復康合劑中落新婦苷和蘆丁進行定性和定量測定，方法快速，可以作為企業內控標準方法，在產品工藝參數不斷調整優化的過程中，具備精準快捷、經濟環保的特點，可有效控制腎復康合劑的質量。