李早霞，衣文索，顏識涵，王化斌

（1.長春理工大學 光電工程學院，長春 130022；2.中國科學院重慶綠色智能技術研究院，重慶 400714）

脫氧核糖核酸（DNA）是由兩條鏈（由核苷酸組成）組成的分子，它們彼此纏繞以形成雙螺旋結構，攜帶著生物生長、發育和繁殖的遺傳指令。目前生物體內與藥物作用的三種主要靶向分子分別為酶、受體及核酸，其中以酶和受體為靶的藥物設計開始較早，而以核酸為靶的藥物研究則起步較晚［1］。研究DNA與藥物小分子之間的相互作用將有助于理解某些藥物分子對DNA復制及轉錄的影響［2］；有助于闡明一些致癌物質或者一些抗腫瘤、抗病毒藥物的作用機制，幫助人們了解某些疾病的發病機制和藥物的治病機理；有助于發現和篩選新型小分子藥物。

目前，已經有許多技術用于研究小分子與DNA之間的相互作用，如光譜方法、電泳和電化學方法、核磁共振技術和微量熱法等［3］。其中光譜方法如熒光光譜、紅外光譜、拉曼光譜等作為物理方法，具有良好的應用前景。這些技術的開發和發展促進了新藥的發現，并在臨床治療的研究和應用方面取得了很大進展。但熒光光譜需要標記分子，可能會導致觀察到的現象中包含非目標分子信息［4］；而紅外光譜主要反應官能團的信息，對分子整體構象變化不敏感，不適用于非共價鍵結合模式；拉曼光譜由于需要激光激發，極易導致被測樣品的損壞，影響測試的準確性［5］。因此，不斷研究新型檢測技術是發展藥物開發的必要手段。開發快速、靈敏的技術來研究DNA和藥物之間的相互作用，可以為進一步加快藥物開發的過程提供技術支持。

基于飛秒脈沖激光的太赫茲時域光譜檢測技術能夠做到對待測對象高靈敏、無損傷的檢測。太赫茲波通常是指頻率范圍在0.1THz～10THz內的電磁波，其在電磁波波譜中介于微波和紅外輻射之間，處于由電子學向光子學過渡的區域。很多生物大分子的振動和轉動能級以及晶體中晶格的振動吸收均對應于太赫茲波段。藥物小分子與DNA相互作用的主要作用模式之一是非共價鍵結合，太赫茲光譜能夠表征非共價鍵作用，包括分子內和分子間的振動和轉動能級、氫鍵和范德華力［6］，所以太赫茲光譜在檢測小分子藥物方面具有很大潛力。在被測對象的不同狀態和反應過程中，通過分析太赫茲波段內獨特指紋特征的變化，可以研究化學和生物分子、化合物的構象和結構動力學信息。

亞甲基藍（MB）已被證明通過非共價鍵作用與DNA發生強烈相互作用［7］。MB首先由Heinrich Caro于1876年制備，它是一種化學式為C16H18N3SCl的雜環芳香族化合物，已被廣泛用于生物和化學領域［8］。實驗以亞甲基藍為例，測試了其單組分及與雙鏈DNA（來源于玉米基因組DNA）及單鏈DNA（來源于鮭魚精）物理混合和溶解結晶的太赫茲光譜。當MB與雙螺旋DNA以溶解結晶的方式結合后，水合MB的特征吸收峰消失；而簡單的物理混合則不會造成這一現象。MB水合物光譜中太赫茲特征吸收峰的保留或消失表明了物理或化學變化的差異。以此可以確定藥物小分子與DNA是否發生了相互作用。

1 實驗

1.1 樣品制備

亞甲基藍水合物（CAS號7220-79-3）和單鏈DNA（CAS號438545-06-3）購自Aladdin（中國上海）。實驗中其它所用溶劑均購自SCR（中國上海）。快速DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。亞甲基藍水合物及無水合物參照報道的重結晶方法制備［8］。雙鏈DNA來源于參照標準方案從玉米葉組織中純化的基因組DNA。物理混合物的獲得是通過使用渦旋混合器在玻璃小瓶中以質量比為1∶1的比例輕輕混合。溶解結晶是通過在不同材料比例的H2O水溶液中37℃重結晶，隨后在室溫和高濕環境下暴露24小時以上。然后使用手動壓片機壓制直徑為15.0mm，厚度為約1.0mm的樣品進行測量。

1.2 太赫茲光譜儀

太赫茲時域光譜技術（Terahertz time-domain spectroscope，THz-TDS）是利用太赫茲脈沖在樣品表面發生反射或透射過樣品后所產生的太赫茲時域信號，然后經過傅里葉變換獲得頻域上的振幅及相位的變化［9］。

實驗使用Picometrix T-ray 5000光纖耦合光譜儀（Advanced Photonix，Inc.，MI，USA）以透射模式進行太赫茲光譜測量。光譜儀使用飛秒激光脈沖和LT-InGaAs光電導天線來生成相干探測時域系統中超短太赫茲脈沖電場。T-ray 5000裝置原理圖如圖1所示，飛秒脈沖激光器發出的激光（中心波長1064nm，重復頻率100MHz）經過激光分束鏡分為兩路，一路為泵浦激光，另一路為探測激光。泵浦激光激發光電導發射天線輻射出太赫茲波，然后太赫茲波經左右對稱的一對高阻硅透鏡后照射到光電導探測天線。在此過程中，通過光學延遲線改變探測激光和泵浦激光之間的光程差實現時域等效采樣而得到完整的太赫茲時域信號［10］。對太赫茲時域波形進行傅里葉變換可以得到該電磁脈沖在頻率域的分布。

太赫茲光譜測量環境均在溫度21.0±0.4℃，相對濕度＜2.0%條件下進行。

圖1 T-ray 5000裝置原理圖

2 結果與討論

2.1 亞甲基藍的太赫茲光譜特征

水合是水分子在物質中存在的一種重要形式，分子的水合常常會引起其物質性質的變化。五水MB及無水MB在0.2～2.0THz的太赫茲吸收光譜顯示如圖2所示，MB五水合物的太赫茲吸收光譜在位于0.85THz和1.62THz有明顯的特征吸收峰；而無水MB在測量光譜范圍內則沒有發現特征吸收峰。

圖2 亞甲基藍的太赫茲光譜特征

結果表明MB五水合物和MB無水合物的太赫茲吸收特征與MB分子的結晶狀態及相互作用有關。在咖啡因的太赫茲光譜中也觀察到由結晶水變化及分子相互作用改變引起的太赫茲吸收光譜的差異［11］。

2.2 亞甲基藍與DNA不同結合方式下的太赫茲吸收光譜

小分子藥物與DNA的特異性結合，在基因表達的調控過程及很多抗癌藥物的體內作用方式的研究中非常重要［1］。為了獲得小分子藥物MB與DNA不同結合方式下的太赫茲吸收光譜，實驗又分別測試了五水MB和DNA在溶解結晶和物理混合狀態下的太赫茲光譜，結果如圖3所示。溶解結晶的太赫茲吸收光譜失去了0.85THz和1.62THz頻率下的特征吸收峰，而在物理混合物和單個組分中均存在這兩處頻率下的吸收峰。因為物理混合后MB與DNA分子間作用的距離還不足以達到產生非共價鍵結合，所以保留了各自的特征吸收峰；而溶解能幫助分子間產生非共價鍵結合，使得表征MB原構象特征的特征吸收峰消失。MB水合物光譜中太赫茲特征吸收峰的保留或消失表明了物理或化學變化的差異。以此可以確定藥物小分子與DNA是否發生了相互作用。

有研究表明，單鏈DNA在分子力學性質、吸收光譜、堿基反應性質等方面都和雙鏈DNA不同［12］。實驗又分別對五水MB和單、雙鏈DNA進行了太赫茲光譜檢測。圖3（a）表明檢測MB水合物與單鏈DNA無論物理混合或是溶解后再結晶，其產物的太赫茲吸收光譜中都包含兩個特征吸收峰；圖3（b）表明檢測MB水合物與雙鏈DNA的物理混合物時，這些太赫茲光譜特征仍然存在。而檢測MB水合物與雙鏈DNA結合形成的溶解結晶時，MB水合物太赫茲吸收光譜中的吸收峰消失。物理混合后由于各組分間空間距離不足以引發物質間相互作用，混合物的光譜特征源于各組分各自信息的疊加［13］，MB與DNA物理混合同MB水合物的太赫茲特征吸收峰位置基本相同；而溶解可提供各組分發生相互作用的條件，但MB與單鏈DNA溶解結晶后依然具有同MB水合物相同位置的太赫茲特征吸收峰，說明這個體系內的MB水合物未發生構象變化，而與雙鏈DNA溶解結晶后特征吸收峰消失說明MB同雙鏈DNA發生了反應。溶液中，MB與雙鏈DNA發生非共價鍵結合［14］。MB與雙鏈DNA兩者的相互作用會引發MB水合物構象的變化，使其失去了原本的太赫茲特征吸收峰。

圖3 MB水合物與DNA相互作用的太赫茲吸收光譜

眾所周知，共結晶是由于兩種或多種不同組分分子之間的分子間氫鍵、非離子鍵或其他非共價鍵相互作用而產生的。MB可以與雙鏈DNA相結合，該結果意味著形成的共結晶改變了MB的組成和分子間或分子內的相互作用，這與單親組分的晶格顯著不同。因此，在這些光譜中觀察到的特征吸收峰的消失是由于分子間非共價鍵結合使得MB水合物失去了原有的光譜特征。

2.3 亞甲基藍與DNA不同濃度結合的太赫茲吸收光譜

太赫茲吸收光譜特征吸收峰振幅的高低可以反應對應物質的量的多少，圖4是DNA與MB在1∶1、2∶1、4∶1這三種濃度比例下，對溶解后的析出物的檢測結果。

圖4 DNA與MB不同濃度比例的結合

圖4（a）中是單鏈DNA與MB不同濃度比例的混合。由圖中可以看出，單鏈DNA與MB以1∶1濃度混合時，太赫茲特征吸收峰的峰值最大，隨著DNA與MB濃度比例的增大，相應的特征吸收峰的相對高度明顯降低。MB與單鏈DNA混合降低了檢測物中MB的相對含量，使得特征吸收峰降低。圖4（b）是雙鏈DNA與MB不同濃度比例的結合，由圖3已經知道，MB水合物與雙螺旋DNA結合會使其失去特征吸收峰。MB水合物與雙螺旋DNA濃度比例在4∶1、2∶1的時候沒有特征吸收峰，可以判斷MB已反應完全；濃度比例的結合是1∶1的時候還存在一個小的吸收峰，是由于還有部分MB水合物沒有結合完，所以留存了部分痕跡。說明這種雙鏈DNA與MB反應完全的濃度比例在1∶1和2∶1之間。

3 結論

通過采用太赫茲吸收光譜法檢測亞甲基藍（MB）與雙螺旋DNA之間的相互作用，提供了利用太赫茲光譜檢測小分子藥物的實例。MB水合物與單鏈DNA溶解結晶后由于未發生相互作用反應，沒有導致MB構象的變化；伴隨著與雙鏈DNA溶解結晶后造成的MB構象的變化，MB水合物的太赫茲光譜特征峰消失。說明可以通過監測反應物與產物太赫茲吸收光譜的變化判斷小分子藥物與DNA是否發生了相互作用，為篩選小分子藥物提供了一種無標記檢測新方法。