玉屏風口服液對變應性鼻炎小鼠水通道蛋白5表達的影響

趙梅珍

【摘要】 目的 研究玉屏風口服液對變應性鼻炎（AR）小鼠鼻腔炎癥及水通道蛋白5（AQP5）表達的影響。方法 30只雌性BALB/c小鼠， 隨機分為對照組、鼻炎組和玉屏風口服液組， 各10只。除對照組外， 其他兩組腹腔注射卵清蛋白（OVA）與氫氧化鋁[Al（OH）3]配制的致敏液及OVA滴鼻建立AR小鼠模型。對照組、鼻炎組生理鹽水0.2 ml灌胃， 玉屏風口服液組玉屏風口服液2.0 ml/kg灌胃， 35 d后， 比較三組癥狀評分、血清卵清蛋白特異性IgE（OVA sIgE）和白細胞介素4（IL-4）含量、鼻黏膜病理學改變、AQP5 mRNA和蛋白含量。結果 鼻炎組行為學積分為（7.3±0.5）分， 對照組行為學積分為（1.8±0.3）分， 玉屏風口服液組行為學積分為（2.0±0.2）分。對照組和玉屏風口服液組比較差異無統計學意義（P>0.05）;兩組積分均顯著低于鼻炎組， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。鼻炎組、對照組和玉屏風口服液組血清OVA sIgE含量分別為（1.81±0.32）、（0.25±0.14）、（0.28±0.10）μg/μl。鼻炎組、對照組和玉屏風口服液組IL-4含量分別為（20.10±2.30）、（6.50±1.30）、（6.70±1.50）pg/ml。對照組與玉屏風口服液組的血清OVA sIgE含量及IL-4含量比較， 差異均無統計學意義（P>0.05）;鼻炎組的血清OVA sIgE含量及IL-4含量均高于對照組與玉屏風口服液組， 差異均具有統計學意義 （P<0.05）。鼻黏膜AQP5 mRNA的相對表達量用β-actin校正， 對照組表達量設為1， 玉屏風口服液組和鼻炎組分別為對照組的3倍和173倍。玉屏風口服液組和對照組比較， 差異無統計學意義（P>0.05）;鼻炎組顯著高于玉屏風口服液組和對照組， 差異均具有統計學意義 （P<0.05）。對照組、玉屏風口服液組和鼻炎組AQP5蛋白含量分別為（0.17±0.03）、（0.18±0.01）、（0.53±0.02）ng/ml。玉屏風口服液組和對照組比較， 差異無統計學意義（P>0.05）;鼻炎組顯著高于玉屏風口服液組和對照組， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。結論 玉屏風口服液可減輕AR小鼠鼻黏膜炎癥， 降低細胞因子分泌和AQP5表達， 減輕鼻黏膜細胞的受損程度， 對AR小鼠鼻黏膜有保護作用。

【關鍵詞】 玉屏風口服液;變應性鼻炎;水通道蛋白5

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.18.112

變應性鼻炎（allergicrhinitis， AR）指接觸變應原后， 免疫球蛋白E（IgE）介導的介質釋放， 多種免疫細胞、細胞因子等參與的鼻黏膜非感染性炎性疾病。其發病率高達10%～40%且逐年上升， 嚴重影響患者生活和工作， 給社會、家庭帶來巨大經濟負擔[1]。其發病機制尚不明確。玉屏風口服液的主要成分為黃芪、防風、白術（炒）， 黃芪和白術均能抗炎及提高機體免疫力[2]， 其抑制IgE產生和抗炎性介質及中和變應原， 其抗過敏作用確切[3]。本實驗通過觀察其對水通道蛋白5 （aquaporin5， AQP5）表達水平的影響， 研究AR發病機制， 探討其對AR的治療作用。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 廣東省實驗動物中心購BALB/c小鼠30只， 雌性， SPF級， 6～8周齡， 20 g/只。飼養1周。隨機分為對照組、鼻炎組和玉屏風口服液組， 每組10只。

1. 2 試劑 OVA（A5503， Sigma）， 玉屏風口服液（湖北東信藥業有限公司）， Mouse OVA-sIgE ELISA Kit （武漢華美）， Mouse IL-4 Quantikine ELISA Kit（R&D）， Anti-Aquaporin 5 antibody（AB78486， Abcam）， PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（6210A， takara）， SYBR Premix Ex TaqⅡ（RR820A， takara）， 細胞膜蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（P0027， 碧云天）。

1. 3 致敏、激發和給藥 20 μg OVA與2 mg Al（OH）3溶于100 μl生理鹽水， 鼻炎組1、7、14、21 d腹腔注射， 對照組采用生理鹽水;鼻炎組和玉屏風口服液組小鼠兩側鼻腔各滴10 μl 10%OVA， 28～35 d， 對照組采用生理鹽水;對照組、鼻炎組采用生理鹽水0.2 ml灌胃， 玉屏風口服液組采用玉屏風口服液2.0 ml/kg灌胃， 均從致敏第1天開始， 致敏前1 h給藥， 35 d。

1. 4 項目觀察和檢測方法

1. 4. 1 癥狀學觀察 最后一次滴鼻24 h內， 三組用OVA各滴鼻1次， 觀察每只小鼠30 min， 記錄其噴嚏、搔鼻和鼻涕量。噴嚏1～3次/輕擦鼻數次/少量鼻涕各1分， 噴嚏4～10次/

摩擦兩鼻孔間/鼻涕較前增加各2分， 噴嚏>11次/摩擦鼻周四處/涕流滿面各3分。總分>5分示造模成功。

1. 4. 2 血清OVA sIgE和IL-4含量 最后一次滴鼻24 h后， 摘眼球取血， 3000 r/min， 收集血清。酶聯免疫吸附實驗（ELISA）法檢測血清OVA sIgE和IL-4含量， 酶標儀（品牌：Melecullar Devices， 型號：PARADIGM）檢測采集數據。

1. 4. 3 鼻黏膜病理學改變 最后一次滴鼻24 h后斷頸處死小鼠， 取鼻中隔黏膜， HE染色， 用熒光倒置相差顯微鏡觀察中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞等浸潤情況。

1. 4. 4 檢測AQP5 mRNA含量 常規Trizol法提取總RNA。據PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書將2 μg RNA反轉錄為cDNA。引物序列：AQP5 正向：5-GGC CAC ATC AAT CCG GCC ATT A-3， 反向：5-GGC TGT TCC ATG AAC CCA GCC-3;β-actin 正向：5-TGC TGT CCC TGT ATG CCT CT-3， 反向：5-TTG ATG TCA CGC ACG ATT TC-3。

據SYBR Premix Ex TaqⅡ說明書， 用熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國ABI， 7500Fast）擴增。

1. 4. 5 Western blot檢測AQP5蛋白含量 試劑盒提取鼻黏膜AQP5蛋白， 常規WB進行SDS-PAGE電泳， 凝膠成像分析系統和IPP6.0圖像分析軟件拍照和分析條帶灰度值。

1. 5 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 癥狀評分 鼻炎組：行為學積分（7.3±0.5）分， 模型成功。對照組和玉屏風口服液組：行為學積分分別為（1.8±0.3）分和（2.0±0.2）分， 模型未成功， 兩組比較差異無統計學意義（P>0.05）;兩組積分均顯著低于鼻炎組， 差異均具有統計學意義 （P<0.05）。

2. 2 血清OVA sIgE和IL-4含量 鼻炎組、對照組和玉屏風口服液組血清OVA sIgE含量分別為（1.81±0.32）、（0.25±0.14）、（0.28±0.10）μg/μl。鼻炎組、對照組和玉屏風口服液組IL-4含量分別為（20.10±2.30）、（6.50±1.30）、（6.70±1.50）pg/ml。對照組與玉屏風口服液組的血清OVA sIgE含量及IL-4含量比較， 差異均無統計學意義（P>0.05）;鼻炎組的血清OVA sIgE含量及IL-4含量均高于對照組與玉屏風口服液組， 差異均具有統計學意義 （P<0.05）。

2. 3 鼻黏膜病理學改變 鼻炎組鼻黏膜不完整， 組織間質水腫明顯， 小血管擴張， 大量嗜酸性細胞、淋巴細胞、漿細胞浸潤;對照組與玉屏風口服液組均鼻黏膜上皮完好， 組織間隙無明顯水腫、血管未見擴張， 僅見少量淋巴細胞、中性粒細胞浸潤。

2. 4 鼻黏膜AQP5 mRNA含量 鼻黏膜AQP5 mRNA的相對表達量用β-actin校正， 對照組表達量設為1， 玉屏風口服液組和鼻炎組分別為對照組的3倍和173倍。玉屏風口服液組和對照組比較， 差異無統計學意義（P>0.05）;鼻炎組顯著高于玉屏風口服液組和對照組， 差異均具有統計學意義 （P<0.05）。

2. 5 Western blot檢測AQP5蛋白含量 對照組、玉屏風口服液組和鼻炎組AQP5蛋白含量分別為（0.17±0.03）、（0.18±0.01）、（0.53±0.02）ng/ml。玉屏風口服液組和對照組比較， 差異無統計學意義（P>0.05）;鼻炎組顯著高于玉屏風口服液組和對照組， 差異均具有統計學意義 （P<0.05）。

3 討論

隨著社會工業化發展， AR發病率逐年增高， 嚴重影響患者生活、健康和工作[4]。流涕過多是AR的主要癥狀之一， 如何有效改善及研究其機制是關注的重點。AQP5在維持鼻腔液體平衡中的作用最重要， 主要分布在小鼠鼻黏膜纖毛柱狀上皮細胞、腺上皮細胞和內皮細胞[5]。中醫將AR歸為“鼻鼽”病[6]， 主要是肺陽不足且風邪入侵致肺氣受阻[7]。黃芪益氣固表、實衛止汗;白術健脾益氣;防風祛風解表。玉屏風口服液可固表止汗、補氣虛、固表虛、增強人體抵抗外邪的能力且具有抗炎的藥理作用。

本研究結果表明， 玉屏風口服液顯著降低血清OVA sIgE和IL-4含量及小鼠鼻黏膜AQP5表達， 減輕組織間質水腫、小血管擴張及炎癥細胞的浸潤。

綜上所述， 玉屏風口服液可改善流涕等癥狀， 有效改善通氣功能及炎性因子反應， 為改善AR提供理論依據。

參考文獻

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[2] 肖新云， 趙先平， 唐標， 等. 七味白術散對菌群失調腹瀉小鼠血常規的影響. 微生物學通報， 2015， 42（2）：325-331.

[3] 舒維萍. 人參五味子湯加減治療小兒哮喘緩解期的效果分析. 湖南中醫藥大學學報， 2016， 36（A02）：964.

[4] Cagnani CE， Sole D， Diaz SN， et al. Allergic rhinitis update and its impact on asthma （ARIA 2008）. Latin American perspective. Revista Alergia Mexico， 2009， 56（2）：56-63.

[5] Lei F， Zhao XD， Zhu JG， et al. Expression and its significance of aquaporin 5 in rat nasal mucosa of experimental allergic rhinitis. Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery， 2005， 40（3）：172-175.

[6] 錢雅琴， 朱玲， 吳飛虎. 復方辛夷滴鼻液鼻腔沖洗治療變應性鼻炎療效觀察及對鼻腔分泌物嗜酸性粒細胞的影響. 中國中西醫結合耳鼻咽喉科雜志， 2018， 26（3）：198-202.

[7] 張朝梅， 陳雪梅. 柴胡桂枝湯聯合西替利嗪治療過敏性鼻炎的療效及對炎性細胞因子的影響. 世界中醫藥， 2017， 12（9）：2065-2068.

[收稿日期：2019-04-02]