高效液相色譜-三重四極桿質譜法同時測定煙葉中10種多酚類化合物

劉萍萍，盧紫舒，羅朝鵬，李澤鋒，翟 妞，鄭慶霞，盧 鵬，曹培健，周會娜，陳千思*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001

2.鄭州大學化學與分子工程學院，鄭州高新技術產業開發區科學大道100號 450001

多酚類化合物是植物中一類重要的次生代謝產物，在煙草中主要以葡萄糖苷和酯的形式存在。多酚類化合物可從植物中提取得到，具有良好的抗氧化性能，廣泛應用于食品、醫學領域［1-5］。蕓香苷和原花青素可作為天然抗氧化劑；綠原酸具有廣泛的抗菌作用；花青素可用于食品、染料、醫藥、化妝品等方面［6］；山奈酚廣泛存在于水果、蔬菜及飲料中，具有防癌抗癌的功效；氯化飛燕草色素、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷、莨菪亭、鼠李金具有一定的抗氧化功能［7-8］。研究表明，多酚類化合物對煙草生長發育有重要影響，同時也與烤煙的感官質量緊密相關［9-10］。

烤煙中的多酚類化合物有多種，其中蕓香苷、綠原酸的質量分數最高，綠原酸占多酚類化合物總量的75%～90%［11］。其他質量分數低的多酚類化合物在煙草品質鑒定與改善方面也有輔助作用。因此，準確測定煙草中多酚類化合物對于煙草鑒定、煙草制品質量控制及卷煙設計具有重要意義［10］。煙草中成分復雜，多酚類化合物質量分數差異較大，有些化合物質量分數偏低且不易檢測［12］。因此選用合適的樣品處理和檢測方法尤為重要。

國內外關于煙葉中多酚類化合物的定性定量分析已有較多報道，主要有毛細管電泳法、分光光度法、GC法、LC法、HPLC-MS法等［13-18］。其中HPLC-MS法由于樣品處理簡單、靈敏度高、定性定量結果可靠、快速簡便、自動化程度高、回收率高、適用于復雜基質樣品的分析等［19-24］，近年來已經發展為多酚類檢測的主流方法，并已用于煙草中綠原酸、蕓香苷的定性定量分析［12］，但對于煙草中低質量分數的多酚類化合物的測定還鮮見相關報道。本研究中基于HPLC-MS/MS技術，采用內標法，建立了一種可以同時檢測煙葉中10種多酚類化合物的方法，旨在為同時檢測煙葉中多種多酚類化合物提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

K326煙草生長于25℃、16 h/8 h光暗交替條件下，收集TMV感染組和對照組的第三、第四葉位葉片，立即置于液氮中冷凍至干，-80℃保存。每組分別取3株煙草的煙葉樣品，每株為一個重復。

甲酸（質譜純），山奈酚（Kaempferol）、花青素（Cyanidin）、氯 化 飛 燕 草 色 素（Delphinidin chloride）、鼠 李 金（Rhamnazin）、綠 原 酸（Chlorogenic acid）、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷（Delphinidin 3-O-β-glucopyranoside chloride）、原花青素B2（Procyanidine B2）、氯化花青素鼠李葡糖苷（Keracyanin chloride）、蕓香苷（Rutin）、莨菪亭（Scopoletin）、傘形花內酯（Umbelliferone）（標準品）（美國Sigma Aldrich公司）；乙醇（色譜純，德國Merck公司）。

1260/6490液相色譜-三重四極桿質譜聯用分析儀（美國Agilent公司）；BEH Phenyl色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）（美 國 Waters公 司）；BSA224S-CW精密天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius公司）；PP020XXM1超純水儀（英國Elga公司）；SPD111V真空濃縮儀（美國Thermo公司）；KQ-700DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；5424離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取

取50 mg冷凍干燥后的煙葉樣品，用研磨機研磨成粉末后，將其轉入1.5 mL（2 mL離心管）預冷的乙醇-水（4∶1，體積比）提取液中，常溫下超聲1 h；然后14 000 r/min條件下離心12 min，取1 mL上清液，將其真空濃縮成固體。用200 μL 80%乙醇（含75 ng/mL傘形花內酯溶液）復溶，20 000 r/min離心3 min，取上清液，進行HPLC-MS/MS檢測。分析條件：

色譜柱：BEH Phenyl柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸甲醇溶液（B）；洗脫梯度：0～2 min B相由5%升到15%，2～10 min B相保持15%，10.01 min～15 min B相升到100%；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：1 μL。電噴霧電離源電離；正離子電離模式下毛細管電壓為4 kV；霧化氣壓力為275.6 kPa；干燥氣流量為12 L/min；干燥氣溫度為290℃；鞘氣流量為11 L/min；鞘氣溫度為200℃；采用實時多反應監測（DMRM）模式掃描。10種多酚類化合物的質譜采集參數見表1。10種化合物母離子均為M+H+峰（本研究中未考察體系中K+、Na+的影響）。

表1 10種多酚類化合物標準品在DMRM模式下的采集參數Tab.1 Collection parameters of ten polyphenol standard samples under DMRM mode

1.2.2 回收率測定

稱取12份相同質量的煙葉樣品，平均分為4組。分別向4組樣品加入終濃度為0、5、15、30 μg/mL相同體積的10種多酚類化合物混合標準液，按照上述條件進行分析，每種化合物的分析結果值分別為C0、C5、C15、C30，分別按照公式（1）～公式（3）計算方法的加標回收率：

終濃度5 μg/mL：

終濃度15 μg/mL：

終濃度30 μg/mL：

1.2.3 基因表達分析

RNA的提取與反轉錄參照文獻［24］進行。

2 結果與討論

2.1 儀器分析條件的優化

2.1.1 流動相的優化

在流動相中添加少量的添加劑（如甲酸）可以增強質譜離子源的離子化效率［25］。分別考察了不添加以及分別以0.05%（體積比）甲酸、0.1%甲酸、0.2%甲酸和0.3%甲酸作為添加劑時的效果。以峰面積（響應值）作為選擇標準，每一濃度測定3次，取平均值。結果如圖1所示，這10種多酚類化合物在0.1%甲酸時信號強度最好。所以選擇流動相中添加0.1%甲酸。

2.1.2 質譜參數的選擇

對10種多酚類物質標準溶液進行質譜分析，山奈酚、花青素、氯化飛燕草色素、鼠李金、綠原酸、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷、原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷、蕓香苷、莨菪亭在正離子模式下主要產生M+H+準分子離子峰，其母子離子（m/z）分別為 287.1/152.9、288.07/213.9、303/228.9，331.1/315.9，355.11/163.1，465.1/302.8，579.2/127，595.2/286.8，611.2/302.9，193.05/132.9。 這些離子響應值高且結果穩定、重現性好，雜質干擾也較少，選為定量定性離子對，用于對樣品中10種多酚類化合物的定量。10種標準品及內標的質譜響應如圖2所示。橫坐標為時間（min），縱坐標為響應值。這10種植物多酚類化合物幾乎互不干擾，能夠得到較好的分離。

圖1 流動相中不同濃度甲酸對10種植物多酚類化合物質譜響應峰面積的影響Fig.1 Effects of formic acid at different concentrations on spectral response peak areas of ten polyphenols in flowing phase

圖2 10種植物多酚類化合物混合標準品的多反應監測離子流圖Fig.2 A flow-diagram of multiple reaction monitoring ions of ten polyphenols in mixed standard

2.2 方法的日內日間精密度、標準曲線與檢出限

2.2.1 日內、日間精密度

標準品混合溶液中山奈酚、花青素、氯化飛燕草色素、鼠李金、綠原酸、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷、原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷、蕓香苷、莨菪亭、傘形花內酯的濃度分別為1.3、1.2、0.8、2.1、2.0、2.0、0.4、2.0、1.5、2.6 μg/mL。連續進樣5 d，每天測定5次，考察其精密度。結果如表2所示，所有樣品的日內和日間RSD均小于9%，說明儀器狀態良好并且穩定。相對于傳統的酚類物質分析方法，本方法具有分析速度快、精密度高、穩定性良好等優點。

2.2.2 標準曲線與檢出限

用混合標準儲備液分別配制用于離子掃描模式的系列濃度的混合標準溶液，每個濃度測定3次，將山奈酚、鼠李金、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷、原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷、莨菪亭分別配成 25.00、12.50、6.25、3.13、1.57、0.78、0.39、0.19 μg/mL的標準溶液；花青素、氯化飛燕草色素配成 12.00、6.00、4.00、2.00、1.50、1.00、0.50 μg/mL的標準溶液；蕓香苷和綠原酸配成500.00、250.00、175.00、87.50、43.75、21.88、10.94、5.47 μg/mL的系列標準溶液，每份標準溶液中內標傘形花內酯均為0.75 μg/mL。以標準品的峰面積與內標峰面積之比（Y）為縱坐標，標準品的濃度（X，μg/mL）為橫坐標進行線性擬合，結果見表3。可知，線性擬合的R2在0.999 1～0.999 7之間。表明這10種多酚物質在所試濃度范圍內的響應峰面積與其濃度具有較好的線性關系，可以用于后續樣品中多酚物質的定量分析。同時，以信噪比3∶1計算得到的檢出限在1～200 μg/L之間，發現不同化合物的檢出限相差較大。

表2 測定結果的日內RSD（n=5）和日間RSD（n=5）Tab.2 Intra-day RSDs（n=5）and inter-day RSDs（n=5）of the analytical results （%）

表3 10種植物多酚類物質的線性方程、相關系數及檢出限Tab.3 Linear equations,correlation coefficients（r）and limits of detection（LODs）of ten polyphenols

2.3 方法的回收率

方法的加標回收率結果見表4。10種多酚類化合物的加標回收率在79.66%～112.74%之間，表明本方法的可靠性較高。

表4 10種植物多酚類化合物的加標回收率和RSD（n=3）Tab.4 Spiked recoveries of ten polyphenols and RSD（n=3）

2.4 煙葉樣品的檢測

2.4.1 提取液的選擇

由于煙葉樣品基質較為復雜，在提取時，不同提取液的提取效率存在差異。因此需要選擇合適的提取液，以獲得較高的響應值信號。取50 mg干煙葉樣品，然后分別用1.5 mL的50%乙醇、80%乙醇、100%乙醇、50%甲醇、80%甲醇、100%甲醇提取液，按照1.2節的方法提取煙葉樣品中的多酚類化合物，最后均復溶到200 μL提取液中。圖3顯示了不同提取液對多酚類化合物檢測響應的影響，橫坐標為提取液濃度，縱坐標為響應值的對數值。可見，除了鼠李金外，其他多酚類化合物在提取液為80%乙醇或者80%甲醇時，響應值相對較高，且山奈酚、花青素、蕓香苷、莨菪亭等多酚類化合物在80%乙醇下的提取效率明顯好于80%甲醇。從提取效率、安全性等方面綜合考慮，選擇使用80%乙醇作為煙葉樣品多酚類化合物的提取劑。

2.4.2TMV接種煙葉的PCR測定

圖3 不同提取液對10種多酚類化合物響應值的影響Fig.3 Effects of different extraction solvents on response values of ten polyphenols

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應的結果見圖4。可見，在3株接種TMV病毒的煙葉上均檢測到TMV特異條帶，表明接種成功，煙葉已感病，可以用來分析TMV病毒感染對煙葉多酚類化合物質量分數的影響。

2.4.3 TMV病毒感染對煙葉多酚類化合物質量分數的影響

按照建立的方法對接種過TMV的K326煙葉以及其對照組的K326煙葉葉片的10種多酚類化合物質量分數進行測定。每個樣品取3個平行樣作為生物學重復，采用1.2節的方法進行3次平行測定，根據標準曲線計算得到每種多酚類化合物的質量分數，取平均值，并計算樣品間標準偏差（RSD，%）；進行T檢驗分析（表5）。

圖4TMV特異引物對煙葉樣品PCR檢測的電泳結果Fig.4 Result of electrophoresis by TMV specific primers for PCR detection of tobacco samples

表5 TMV病毒感染對煙葉中10種植物多酚類物質質量分數的影響①Tab.5 Effects of TMV infection on contents of ten polyphenols in tobacco leaves （μg·g-1）

由表5可以看出：感染TMV的植株極顯著（p＜0.01）增加了煙葉中山奈酚、花青素、氯化飛燕草色素、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷、蕓香苷的質量分數，顯著（p＜0.05）增加了煙葉中綠原酸的質量分數，顯著（p＜0.05）降低了煙葉中鼠李金的質量分數，TMV病毒感染對原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷和莨菪亭的影響不大，差異并不顯著；TMV病毒感染極大地上調了蕓香苷的質量分數，在TMV感病煙葉中，蕓香苷質量分數比對照增加了近兩倍。有文獻報道［21］表明CMV病毒感染的植株中總酚化合物質量分數上升，但未說明具體是哪些酚類化合物上調或上調較大。本研究中TMV感染煙草葉片中的多數多酚類化合物質量分數也升高了，其總酚質量分數也明顯增加，主要以蕓香苷為主。

3 結論

①建立了利用高效液相色譜—三重四極桿質譜同時分析并定量檢測煙葉中10種多酚類化合物的方法，包括山奈酚、花青素、氯化飛燕草色素、鼠李金、綠原酸、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷、原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷、蕓香苷、莨菪亭，該方法的精密度良好、可靠性較高。②利用該方法分析了TMV感染對煙葉多酚類化合物質量分數的影響，山奈酚、花青素、氯化飛燕草色素、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷、蕓香苷在感染TMV的植株中質量分數顯著上升，原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷和莨菪亭在感染TMV的植株中質量分數并無顯著變化，其他2種多酚類化合物質量分數出現輕微的上調和下調。③本方法可用于同時分析煙葉中的多酚類化合物。