煙草根系分泌物對黑脛病菌菌絲生長的影響

婁曉平，趙炯平，王海波，汪海生，王 鋼，朱曉明，時 焦*

1.浙江中煙工業有限責任公司，杭州市中山南路77號 310009

2.中國農業科學院煙草研究所，山東省青島市嶗山區科苑經四路11號 266101

3.江蘇省植物保護植物檢疫站，南京市鼓樓區月光廣場8號 210036

4.華環國際煙草有限公司，安徽省鳳陽縣門臺工業園區 233121

煙草黑脛?。跴hytophthoraparasiticavar.nicotianae（Breda de Hean）Tuker］是煙草生產上的一種毀滅性土傳病害［1-3］，其發病率輕病區通常為5%～15%，重病區可高達30%以上，個別田塊甚至煙株全部死亡［4］。作物品種抗病機理研究是作物病害防治的基礎。當植物受到土傳病原菌侵染時其根系分泌物對病原菌會產生一定的作用，根系分泌物可以直接影響土傳病原菌的生長與繁殖，最終影響植物的發病率。有研究表明，不同抗性的作物品種其根系分泌物對病原菌的影響不同，抗病品種的根系分泌物通常能夠抑制病原菌生長，而大多感病品種的根系分泌物則促進病原菌生長［5-9］。湯東生等［10］研究發現，高濃度大蒜根系分泌物能顯著抑制石榴枯萎病菌（Ceratocystis fimbriata）菌絲的生長。而有關不同抗性水平煙草品種根系分泌物對煙草黑脛病菌的作用尚未見詳細報道。為此，以4個高抗黑脛病的煙草品種和4個高感黑脛病的煙草品種為試驗材料，進行了煙草品種根系分泌物對黑脛病菌生長的影響試驗，旨在探討煙草品種對黑脛病的抗性機理，為煙草黑脛病的有效防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病菌：煙草黑脛病菌［P.parasiticavar.nicotianae（Breda de Hean）］0號生理小種，由中國農業科學院煙草研究所植保研究室保存。

供試煙草（Nicotiana tabacum）品種：黑脛病抗病品種 Florida 301、L8、Beinhart1000-1和革新 3號，與黑脛病感病品種中煙100、貴煙13、紅花大金元和小黃金1025。在溫室中按常規育苗方法培育煙苗，育苗工具、土壤、水和肥料均嚴格消毒。煙苗培育至6～7片真葉期時備用。

培養基：燕麥固體培養基和馬鈴薯葡萄糖固體培養基［11-12］。

1.2 方法

采用浸根法分別收集煙草黑脛病抗病品種Florida 301、L8、Beinhart1000-1和革新3號，以及感病品種中煙100、貴煙13、紅花大金元和小黃金1025健康煙株的根系分泌物。具體方法：將移栽后2周的煙苗從土壤中取出，用無菌水反復沖洗根系，隨后浸入盛有250 mL無菌水的燒杯中，遮光，用燒杯中的水收集各處理根系分泌物12 h。將收集好的浸提液與乙酸乙酯等體積混勻，超聲波振蕩25 min，靜置1 h，然后用分液漏斗分離，將萃取液于旋轉蒸發儀40℃水浴中濃縮至浸膏，再用1 mL甲醇溶解，所得液體經0.22μm的微孔濾膜過濾滅菌，獲得根系分泌物濃縮液，于4℃冰箱中保存備用［13-14］。

采用生長速率法［13,15］測定根系分泌物對煙草黑脛病菌菌絲生長的影響。將上述制備好的根系分泌物濃縮液與已滅菌并冷卻至45℃的馬鈴薯葡萄糖固體培養基（每100 mL培養基含1%氯霉素抑菌劑0.3 mL）以1∶10比例混合，對照為與濃縮液等量的無菌水與前述馬鈴薯葡萄糖固體培養基混合，然后倒入直徑8.5 cm的培養皿中，靜置冷卻，冷凝后于每個培養皿中心接種一塊直徑0.5 cm的黑脛病菌菌餅（提前在燕麥培養基上培養煙草黑脛病菌，然后用直徑0.5 cm的打孔器在菌落邊緣取菌餅），于28℃恒溫培養箱黑暗培養，每24 h用十字交叉法測量菌落直徑，共4次。每個品種測試9株，每株重復6次，并計算菌落直徑平均值和菌絲生長抑制率。

抑制率=［（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑］×100%

1.3 數據處理

利用DPS數據分析軟件，采用Duncan新復極差法對數據進行差異顯著性檢驗［16］。

2 結果與分析

2.1 不同抗性品種煙草根系分泌物對黑脛病菌菌絲生長的影響

表1結果顯示，不同抗性煙草品種根系分泌物對黑脛病菌菌絲生長的影響不同。培養24、48、72和96 h抗煙草黑脛病品種Florida 301、L8、Beinhart1000-1和革新3號根系分泌物處理的黑脛病菌菌落直徑均顯著小于對照（P＜0.05）。說明抗病品種的根系分泌物對黑脛病菌菌絲生長有抑制作用，4個抗病品種的菌絲生長抑制率為5.93%～20.78%。

培養24、48和72 h感病品種貴煙13、紅花大金元和小黃金1025根系分泌物處理的黑脛病菌菌落直徑均大于對照，差異達到極顯著水平（P＜0.01），培養96 h感病品種紅花大金元和小黃金1025品種與對照間差異達到極顯著水平（P＜0.01）。貴煙13、紅花大金元和小黃金1025 3個品種的菌絲生長抑制率為-16.47%～-2.15%。而感病品種中煙100根系分泌物處理培養24、48、72和96 h菌落直徑均小于對照，但差異未達到顯著水平（P＞0.05），菌絲生長抑制率為0.80%～8.65%（表1）。感病品種中煙100菌落直徑與其他感病品種間差異達到極顯著水平（P＜0.01）。說明感病品種中煙100的根系分泌物與其他感病品種的作用相反，對黑脛病菌菌絲生長有抑制作用。

表1 不同抗性品種煙草根系分泌物對黑脛病菌菌絲生長的影響①Tab.1 Effects of root exudates from different tobacco varieties on mycelium growth of P.parasitica var.nicotianae

圖1 煙草黑脛病菌在8個煙草品種根系分泌物中培養120 h的生長狀況Fig.1 Mycelium growth of P.parasitica var.nicotianae on medium with root exudates from 8 tobacco varieties for 120 h

不同煙草品種根系分泌物對黑脛病菌菌絲生長影響的測定結果（圖1）顯示，抗病品種Florida 301、L8、Beinhart1000-1和革新3號根系分泌物處理的菌落直徑明顯小于對照。感病品種貴煙13、紅花大金元和小黃金1025根系分泌物處理的菌落直徑明顯大于對照；而感病品種中煙100品種根系分泌物處理的菌落直徑略小于對照。

3 討論

植物根系向根際土壤中釋放分泌物，根系分泌物對根際生物包括微生物與植物均具有正面和負面作用［17］。根系分泌物對病原菌的作用方式主要有兩種：一是直接作用，根系分泌物或其有效成分對病原菌直接的促進或抑制作用；二是間接作用，根系分泌物通過改變根際微生物結構等方式間接對病原菌產生影響［18］。本試驗中發現，煙草根系分泌物對煙草黑脛病菌菌絲生長的作用與品種抗性有關，抗黑脛病煙草品種根系分泌物對黑脛病菌菌絲生長具有明顯抑制作用，而感黑脛病煙草品種根系分泌物多數具有明顯促進作用，這與前人的研究結果一致。如袁虹霞等［6］研究提出抗病棉花品種根系分泌物對黃萎病病菌的孢子萌發和菌絲生長有一定的抑制作用，而感病棉花品種根系分泌物則能刺激病菌的孢子萌發和菌絲生長；張慶平等［19］和史剛榮等［20］報道蕎麥根系分泌物能夠抑制小麥全蝕病菌的生長；黃奔立等［21］研究發現感病黃瓜品種根系分泌物對黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium）的生長具有促進作用；朱文杰等［22］研究認為，加拿大一枝黃花（Solidago canadensisL.）根系分泌物可有效抑制土傳病原菌的生長，隨著根系分泌物濃度的升高，土傳病原菌生長抑制率提高。而有關抗病煙草品種根系分泌物抑菌物質的有效成分在本試驗中尚未涉及，馮超等［23］研究表明，煙草黑脛病感病品種小黃金1025和抗病品種革新3號根系分泌物中，共有成分含量差異較大的化合物為酒石酸、二硝托胺、茉莉酮、棕櫚酸和油酸。低濃度（100 μg/mL）條件下5種化合物對煙草黑脛病菌均具有顯著的抑制效果,且隨濃度的增加其抑制效果增強。因此，在抗病煙草品種根系分泌物抑菌物質的種類鑒定及作用機制方面還有待進一步深入研究。

本試驗中還發現感病煙草品種中煙100對黑脛病菌菌絲生長沒有促進作用。中煙100品種的感病原因可能是根系分泌物通過改變根際微生物結構等方式而間接對病原菌產生影響。Vives-Peris等［17］報道耐鹽與耐高溫柑橘品種的根系分泌物能夠促進根際細菌的生長，是因為這些根系分泌物中含有大量的脯氨酸與水楊酸鹽調控了根際微生物菌群結構。中煙100品種根系分泌物對煙草黑脛病菌菌絲生長的抑制作用可能與煙草品種感病機制的差異有關，這也有待進一步的試驗驗證。

4 結論

以煙草抗黑脛病品種Florida 301、L8、Beinhart1000-1和革新3號，以及感黑脛病品種中煙100、貴煙13、紅花大金元和小黃金1025的盆栽煙苗為試驗材料，通過生長速率法測定根系分泌物對黑脛病菌菌絲生長的影響試驗結果表明，煙草品種根系分泌物對黑脛病菌菌絲生長的作用與品種抗性有關。4個抗病品種Florida 301、L8、Beinhart1000-1和革新3號的根系分泌物對黑脛病菌菌絲生長有明顯抑制作用。感病品種的情況表現不一致，其中感病品種貴煙13、紅花大金元和小黃金1025根系分泌物對黑脛病菌菌絲生長有促進作用，而感病品種中煙100沒有表現出促進作用，這說明不同抗性水平煙草品種的根系分泌物對煙草黑脛病菌菌絲生長的作用不同。