鎘脅迫下生物炭與鋅/鉀葉面肥促進煙草生長降低鎘富集的協同效應

劉 領，悅飛雪，李繼偉，李 冬，王艷芳

（河南科技大學農學院，河南洛陽 471023）

煙草作為一種重要的經濟作物，其品質提高和無公害生產一直是煙草行業研究的重點。隨著人們對“吸煙與健康”的日益關注，煙葉安全性問題越來越受重視，其中煙草與重金屬的關系及其調控技術研究已成為國內外煙草研究的熱點之一[1]。鎘是土壤中重要的重金屬污染元素之一，由于其在土壤中具有較強的移動性，極易被煙草葉片吸收富集[2]。煙葉中過量的鎘積累不僅會影響煙株的生長發育和產量品質[3-4]，而且在卷煙抽吸的過程中，重金屬鎘還會隨著主流煙氣進入人體，引起器官病變 (如肺氣腫、腸胃病變、貧血及高血壓等)，嚴重危害人類健康[5-6]。因此，如何采取經濟有效的修復措施，減輕鎘對煙株的毒害，降低煙株對重金屬鎘的吸收富集，顯得十分必要。

近年來，由生物質熱解而成的生物炭作為農用土壤改良劑、肥料緩釋載體及碳封存劑已受到國內外研究學者的普遍關注。生物炭通常是由農林廢棄物 (如小薪柴、農作物秸稈、雜草、糞便等) 在限氧或缺氧環境下高溫裂解后的固體產物[7]。生物炭的特性 (如高度穩定性、芳香化結構、富含碳、體小多孔、比表面積大、較強的持水保肥能力等) 已在各個領域被廣范研究[8]，并且在農業生產中應用表現出重要的生態功能，包括增強土壤碳匯、促進養分利用及降低環境污染等[9]。由于生物炭表面富含羧基、酚羥基、羰基、醌基等各種官能團，孔隙結構發達，并且顆粒表面帶有大量負電荷，能夠很好地吸附固定土壤中的重金屬離子，能夠降低重金屬在土壤中的遷移和有效性，減少植物體對重金屬的吸收積累[10-11]，已被證明在土壤污染修復治理中有著廣闊的應用前景。然而，生物炭緩解植物重金屬脅迫的生理生化機制及其與其它修復措施的聯合應用效應仍需要進一步探究。

植物在吸收和利用金屬離子時，不同金屬離子之間會出現離子拮抗作用。研究表明，施用葉面肥不僅可以增加植物的抗性，促進植物生長，而且可以通過離子拮抗作用降低植物對土壤中重金屬離子的吸收轉運，減少植物對重金屬的富集，提高作物生產的安全性[12-13]。磷酸二氫鉀和硫酸鋅作為烤煙生產中常用的葉面肥料具有利用效率高、吸收快等特點，可增加煙株的營養抗性，促進煙葉生長，減輕煙葉病害，提高煙葉產量和品質[14]。然而，重金屬鎘脅迫條件下，兩種不同葉面肥對煙草生長和鎘吸收的影響，以及聯合土壤生物炭修復的耦合效應與機制，目前尚不十分清楚。鑒于此，本試驗采用溫室大棚盆栽模擬輕度鎘污染脅迫的方式，分析比較了生物炭單施、鋅/鉀葉面肥單施及生物炭 + 鋅/鉀葉面肥配施對鎘脅迫下煙草生長、抗氧化酶活性、土壤鎘形態變化及煙株鎘富集特征的影響，旨在為輕度鎘污染土壤的修復利用及煙草安全生產提供施肥依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2016年在河南科技大學農場溫室大棚中進行 (34°61′N，112°42′E)。供試土壤釆自河南科技大學農場0—20 cm耕層，質地為黃潮土。土壤除去石子等雜物后風干過篩備用，供試土壤pH 7.6、有機質12.32 g/kg、總氮0.84 g/kg、堿解氮46.7 mg/kg、速效磷17.1 mg/kg、速效鉀106 mg/kg、全鎘含量0.038 mg/kg、土壤粘粒18.8%、土壤粉粒32.2%、土壤砂粒49.0%。供試生物炭材料購自河南商丘三利新能源有限公司的小麥秸稈生物炭 (于450℃條件下小麥秸稈限氧熱解制成)，基本理化性質為pH 10.4、比表面積8.92 m2/g、有機碳52.2%、全氮5.9 g/kg、全磷0.89 g/kg、全鉀23.2 g/kg。供試葉面肥磷酸二氫鉀和硫酸鋅為優級純配制，購自洛陽市鑫華化工市場。供試烤煙 (Nicotiana tabacumL.) 品種為‘中煙100’，由于煙草種子較小，為了保證煙苗的整齊度采用統一育苗培養至5片葉期，供盆栽試驗使用。供試煙草專用復合肥由洛陽市煙草公司提供 (N∶P2O5∶K2O = 10∶12∶18)。

1.2 試驗設計

試驗共設6個處理：1) 對照 (不施用生物炭和葉面肥，CK)；2) 添加生物炭20 g/kg(B)；3) 葉面噴施0.5%的ZnSO4溶液 (Zn)；4) 葉面噴施0.5%的KH2PO4溶液(K)；5) 添加生物炭20 g/kg土 + 葉面噴施0.5%的ZnSO4溶液 (B + Zn)；6) 添加生物炭20 g/kg土 + 葉面噴施0.5%的KH2PO4溶液 (B + K)。將各處理土壤、煙草專用復合肥 (按純氮 0.2 g/kg土壤計算) 及相應的生物炭混合，通過向混合土樣中噴灑定量CdSO4·8H2O溶液的方法使土壤鎘污染水平為3 mg/kg (依據我國土壤環境質量標準GB15618-1995，模擬輕度鎘污染脅迫水平)，然后用鐵鍬充分摻兌均勻后，裝入塑料盆中 (盆口直徑22 cm、高24 cm)，每盆裝土5 kg。每個處理8個重復，共計48盆，隨機排列于溫室大棚中。

盆栽土壤的含水量調節保持在田間持水量的60%平衡兩個月后[15]，于2016年4月25日移栽煙苗，每盆檢煙1株，每隔2天用稱重法加入去離子水補充水分，控制土壤含水量為田間持水量的70%。煙苗移栽后30天和60天時，葉面肥處理使用小噴壺均勻噴施煙株葉片正背兩面，以葉片附著一層小水滴，無水珠滴下為準，其它處理噴等量的去離子水。煙株移栽后40天選擇各處理中的4個重復，選取煙株從上往下數第4片葉測定鎘脅迫下煙株葉片的生理指標。煙株移栽85天后選擇各處理剩余4個重復測定煙株株高，并整株收獲，同時采集根際土壤樣品。植株按根、莖、下部葉 (從下到上1～5片)、中部葉 (6～10片)、上部葉 (11～15片) 5部分分離，認真清洗干凈后放入烘箱中，105℃殺青30 min后，70℃烘干48 h至樣品恒重，稱取各部分干重，并計算干物質生物量。烘干的各部分組織用粉碎機粉碎后過篩裝于塑料封口袋中保存，用于測定各部位的鎘含量。采集的植物根際土壤樣品0.5 kg，自然風干、過篩，用于測定土壤中不同形態的鎘含量。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 煙株生理指標測定 丙二醛 (malondiadehyde，MDA) 和抗氧化酶活性的測定：取0.5 g新鮮葉片，加液氮充分研磨后，用2 mL 10% 三氯乙酸溶液提取丙二醛。加入2 mL含1% PVP的0.1 mol/mL磷酸緩沖液 (pH 5.5～8.8)，于4℃下13000 r/min離心20 min，所得上清液即為酶粗提液。

MDA含量測定采用硫代巴比妥酸 (TBA) 法[16]；超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD) 測定采用氮藍四唑還原法[17]；過氧化物酶 (peroxidase，POD) 測定采用愈創木酚法[18]；過氧化氫酶 (catalase，CAT) 活性采用紫外吸收法測定[19]。

1.3.2 煙株各部位鎘含量測定 準確稱取0.5 g各部位植物樣品置于消煮管中，優級純HNO3-HClO4(4∶1) 消煮后，采用石墨爐原子吸收分光光度法，和原子吸收光譜儀 (VARIAN AA240) 測定。

1.3.3 土壤各形態鎘含量測定 按照歐盟提出的BCR連續提取法[20]處理樣品，分步驟提取出弱酸提取態、可還原態、可氧化態和殘渣態Cd，離心過濾后得到的提取液用VARIAN AA240測定各形態的Cd含量。

1.3.4 富集系數和轉運系數計算 煙株鎘的生物富集系數 (bio-concentration factor，BCF) 和生物轉運系數 (translocation factor，TF) 計算如下[21]：

植株地上部分鎘含量 (mg/kg) = 煙株地上部分所有組織鎘的總積累量/地上部組織總生物量。

BCF = 植株地上部鎘含量/土壤中的鎘含量，富集系數越大，表示煙株積累重金屬能力越強。

TF = 植株地上部鎘含量/煙株根中的鎘含量，轉運系數越高，表示重金屬從根部轉運到地上的能力越強。

1.4 數據處理和分析

試驗數據基礎分析采用Excel 2007，處理間多重比較采用SPSS 17.0，作圖采用Origin 9.0。

2 結果與分析

2.1 不同處理對煙株株高和生物量的影響

與對照相比，生物炭與葉面肥單獨應用及其聯合處理均顯著增加了煙株的株高、地上部干重和根干重 (P＜ 0.05)。各處理對烤煙株高、地上部干重和根干重的影響表現為 B + Zn ＞ B + K ＞ Zn ＞ K ＞B ＞CK。對株高而言，B、Zn、K、B + K和B + Zn處理與CK相比均顯著增加煙株株高，Zn和K處理之間無顯著差異 (P＞ 0.05)；對地上部干重而言，B、Zn、K、B + K和B + Zn處理與CK相比均顯著增加煙株地上部干重，B和K處理之間無顯著差異；對根干重而言，B、Zn、K、B + K和B + Zn處理與CK相比均顯著增加煙株根干重，B、K和Zn處理之間無顯著差異。總體來看，葉面肥處理對煙株生長的效應大于生物炭處理；B + Zn和B + K處理對提高煙株株高和生物量效果較好，株高分別較對照提高52.8%和46.4%，地上部生物量分別較對照提高146.0%和108.0%，地下生物量分別較對照提高95.9%和55.4%，說明生物炭和葉面肥聯合處理有利于促進煙株的生長 (表1)。

2.2 不同處理對煙株葉片MDA含量和抗氧化酶活性的影響

與CK相比，生物炭、葉面肥單獨施用及其配施均顯著降低煙株葉片中MDA含量 (P＜ 0.05)，各處理效應為 CK ＞ B＞ K ＞ Zn ＞ B + Zn ＞ B + K。B、Zn、K、B + K和B + Zn處理與CK相比均顯著降低煙株葉片MDA含量 (P＜ 0.05)，Zn和K處理之間、B + Zn和B + K處理之間對MDA含量沒有顯著差異(P＞ 0.05)，其中B + K處理對降低MDA含量效果最好，其次是B + Zn處理，分別較對照降低49.4%和44.5%，說明生物炭和噴施葉面肥聯合施用更有利于降低煙株葉片的MDA含量 (圖1A)。

各處理對SOD、POD、CAT酶活性影響的效應表現為 B + Zn ＞ B + K ＞ Zn ＞ K ＞ B ＞ CK。B、Zn、K、B + K和B + Zn處理與CK相比均顯著增加煙株葉片SOD活性 (P＜ 0.05)，Zn、K和B處理之間對提高SOD活性無顯著差異 (P＞ 0.05)。B、Zn、K、B + K和B + Zn處理與CK相比均顯著增加煙株葉片POD和CAT活性 (P＜ 0.05)，Zn和K處理之間、B + K和B + Zn處理之間對POD、CAT酶活性無顯著差異。B + Zn處理對提高SOD、POD、CAT酶活性效果最好，分別較對照提高29.8%、94.0%、183.8%。總體來看，葉面肥處理對提高煙株葉片抗氧化酶活性影響的效應大于生物炭處理；生物炭和葉面噴施ZnSO4聯合處理更有利于提高煙株葉片SOD、POD、CAT酶活性 (圖1)。

表1 不同處理的煙株株高和生物量Table 1 Plant heights and dry weights of tobacco with different treatments

圖1 鎘脅迫下不同處理煙株葉片的MDA含量和SOD、POD、CAT活性Fig.1 MDA contents and SOD, POD, CAT activities in tobacco leaves under Cd stress with different treatments

2.3 不同處理對煙株各部位重金屬鎘含量的影響

煙株各部位 Cd 含量表現為下部葉 ＞ 中部葉 ＞ 根 ＞上部葉 ＞ 莖。各處理對煙株根、莖、葉Cd含量影響的效應均表現為 CK ＞ K ＞ Zn ＞ B ＞ B + K ＞ B + Zn。對煙株根部的鎘含量而言，B、Zn、K、B + K、B +Zn處理與CK相比均顯著降低煙株根部鎘含量 (P＜0.05)，Zn和K處理之間無顯著差異 (P＞ 0.05)；對煙株莖部的鎘含量而言，B、Zn、K、B + K、B +Zn處理與CK相比均顯著降低煙株莖部鎘含量，B、Zn和K處理之間無顯著差異；對煙株上部葉鎘含量，B、Zn、K、B + K、B + Zn處理與CK相比均顯著降低煙株上部葉鎘含量，Zn和K處理之間、B +K和B + Zn處理之間無顯著差異；對煙株中部葉鎘含量，B、Zn、K、B + K、B + Zn處理與CK相比均顯著降低煙株中部葉鎘含量，B和Zn處理之間無顯著差異；對煙株下部葉鎘含量，B、Zn、K、B + K、B + Zn處理與CK相比均顯著降低煙株下部葉鎘含量，不同處理間均表現出顯著差異。B + Zn處理對降低煙株根、莖、上部葉、中部葉、下部葉重金屬鎘含量效果最佳，分別較對照降低53.9%、74.5%、63.1%、63.6%、63.8%。總體來看，生物炭結合葉面噴施ZnSO4更利于減少煙株對重金屬鎘的積累 (圖2)。

2.4 不同處理對煙株鎘的生物富集系數和轉運系數的影響

與CK相比，生物炭與葉面肥單獨應用及其聯合配施均顯著降低煙株Cd的生物富集系數和轉運系數(P＜ 0.05)。各處理對煙株鎘的生物富集系數和轉運系數影響的效應均表現為 CK ＞ K ＞ Zn ＞ B ＞ B + K ＞B + Zn。

對于富集系數而言，Zn和K處理之間、B +K和B + Zn處理之間無顯著差異 (P＞ 0.05)，以B +Zn處理煙株鎘的生物富集系數最低，與CK相比降低64.4%。

圖2 不同處理煙株各部位重金屬鎘含量Fig.2 Cadmium contents in different parts of tobacco with different treatments

對轉運系數而言，K和Zn處理間無顯著差異，以B + Zn處理煙株鎘的生物轉運系數最低，與CK相比降低32.3%。

總體上，生物炭配合葉面噴施ZnSO4更利于降低煙株對重金屬Cd的富集和轉運 (圖3)。

2.5 不同處理對土壤重金屬鎘形態的影響

不同處理下土壤重金屬Cd各形態含量表現為可還原態 ＞ 弱酸提取態 ＞ 可氧化態 ＞ 殘渣態。與對照相比，B、B + Zn和B + K處理顯著降低土壤弱酸提取態和可還原態Cd含量，弱酸提取態Cd含量分別較對照降低12.9%、19.5%、16.9%，可還原態Cd含量分別較對照降低24.4%、22.9%、23.7%；B、B +Zn和B + K處理增加可氧化態和殘渣態Cd含量，可氧化態Cd含量分別較對照增加53.9%、62.5%、61.8%，殘渣態Cd含量分別較對照增加177%、207%、193%。Zn、K處理對弱酸提取態和可還原態Cd含量，可氧化態和殘渣態Cd含量均無顯著影響 (P＞0.05)。B、B + K和B + Zn處理對降低可還原態、弱酸提取態Cd含量，增加可氧化態、殘渣態Cd含量無顯著差異。總體來看，施加生物炭對降低弱酸提取態和可還原態Cd含量，增加可氧化態和殘渣態Cd含量效果較好，噴施葉面肥對土壤Cd形態轉化無顯著影響 (圖4)。

圖3 不同處理煙株中鎘的生物富集系數和轉運系數Fig.3 Bio-concentration factors and transfer factors of cadmium of different treatments

圖4 不同處理的土壤中各形態鎘含量Fig.4 Soil cadmium fractions of different treatments

3 討論

曹晨亮等[22]研究表明，重金屬鎘污染土壤上添加鈍化劑可顯著降低重金屬對煙株的毒害，提高煙葉產量，赤泥、油菜秸稈、玉米秸稈及其組合并配施硫酸鋅可使煙葉增產7.0%～32.1%，煙草經濟效益提高6.6%～31.3%，且以赤泥油菜秸稈復合鈍化劑配施鋅肥效果最佳。

本研究結果表明生物炭和葉面肥均能顯著提高煙株生長和干物質積累，以及煙株葉片的SOD、POD和CAT活性。生物炭能夠提高Cd脅迫下煙株生長和抗性可能是因為：1) 生物炭具有多孔結構，施入重金屬污染土壤中、為土壤微生物提供良好的棲居環境，增強了參與土壤有機養分分解的微生物活性，為植物生長提供了有效利用的養分[5-10]；2) 生物炭施入土壤后降低了重金屬的轉運和積累，減少鎘對煙株的毒害[23-24]。葉面肥富含植物生長所必須的營養元素，噴施葉面肥有利于煙株對營養元素的吸收，調節煙株地上部分的生長，增強煙株的抗性[25]。

本研究還發現生物炭配合葉面噴施ZnSO4對提高Cd脅迫下烤煙的生長和抗氧化能力效果最佳，噴施Zn肥效果好于噴施K肥。這可能是因為生物炭為煙株改善了根際生長環境，而Zn元素是葉綠體中碳酸酐酶的重要組成部分，提高了煙株的光合作用強度[26]，二者對煙株生長起到了協同作用。噴施Zn肥效果好于噴施K肥可能是由于生物炭自身K含量較高，施入土壤后提高了土壤的鉀含量，從而減少葉面對K+的吸收，降低了煙株對Cd2+吸收的阻控效應，因此噴施Zn肥效果好于噴施K肥。

本研究結果發現生物炭能夠較好地阻控煙株對Cd的富集和轉運，減少Cd的吸收積累，降低煙草各部位Cd含量。這可能是因為：1) 生物炭表面帶有大量負電荷與土壤中的金屬離子產生靜電作用，Cd2+被吸附固定，降低了Cd2+的移動性[27]；2) 生物炭表面分布著很多含氧官能團 (如羧基和羥基)，增加土壤表面的吸附位點，Cd2+與這些官能團結合形成金屬絡合物，從而降低Cd的有效性[28]；3) 生物炭的堿性性質 (本研究中生物炭pH值為 10.4)，施入土壤后可能使得土壤中重金屬離子形成氫氧化物、碳酸鹽或磷酸鹽而沉淀，有利于可還原態鎘的形成和穩定[29-30]。

吳萍萍等[23]研究也指出，在礦區重金屬污染土壤中施加生物炭可減少土壤可還原態Cd含量，增加殘渣態Cd含量，增幅為40.9%～191.9%。李衍亮等[31]研究發現在重金屬污染農田中施用生物炭可降低土壤重金屬的生物有效性，減少在玉米中的鎘積累，其中玉米籽粒中Cd含量降低幅度為45.4%。

噴施Zn、K葉面肥能夠降低煙株對Cd的積累轉運，表現出明顯的“離子拮抗”作用，這可能是因為：一方面煙株對葉面肥中金屬陽離子的吸收，調控了細胞中金屬陽離子的濃度，及時關閉金屬陽離子載體蛋白基因表達，減少土壤中Cd2+向地上部轉運，從而調控煙株對重金屬鎘的吸收[32]；另一方面葉面肥能夠促進煙株生長，增加煙株地上部分的生物量，在煙株體內對重金屬鎘起到“稀釋效應”，從而降低鎘在煙株中的濃度[33]。

鈍化劑與葉面肥聯合處理降低植物Cd積累的研究已有部分報道，如徐奕等[34]研究表明坡縷石與葉面硅肥聯合施用能有效降低水稻地上部Cd吸收，秸稈中重金屬Cd含量最大可降低68.7%。

本研究顯示生物炭配施葉面肥促進Cd脅迫下煙株生長，提高抗氧化性，降低Cd富集轉運效果最佳。這可能是由于生物炭能夠調控土壤微環境的理化性質，為根系營養吸收和根際有益微生物繁殖提供了良好條件，且對土壤重金屬離子有較強的吸附鈍化作用，可從根部調控煙株對重金屬鎘的吸收[35-36]；而葉面吸收的Zn2+、K+抑制了煙株對重金屬陽離子的吸收，表現出較強的“離子拮抗”作用，可從地上部調控煙株對重金屬鎘的吸收[32]，因此，在農業生產中生物炭結合噴施葉面肥從調控土壤中的重金屬Cd的形態和阻控地上部對重金屬Cd2+轉運方面雙重支配煙株對重金屬鎘的吸收，具有良好的疊加效應。本研究結果也表明生物炭配合葉面噴施ZnSO4效果好于生物炭配合葉面噴施KH2PO4，可能是因為Zn2+和重金屬Cd2+均為2價態的陽離子，二者的離子拮抗作用較強。

4 結論

土壤鎘污染脅迫條件下，土施生物炭主要通過降低土壤中鎘的生物有效性，減少鎘的吸收及在煙草中的轉運和富集。

葉面噴施鋅/鉀肥主要通過增強煙草植株的抗氧化酶活性，促進煙株生長，降低Cd在煙草體內的相對含量，提高對鎘脅迫的抗性。

生物炭配合葉面肥具有明顯的協同作用，降低煙草中鎘的轉運系數和富集系數的效果顯著高于鋅/鉀葉面肥單獨施用。在本試驗條件下，生物炭配合噴施硫酸鋅的效果好于配合噴施磷酸二氫鉀，可作為提高煙草生產安全及土壤鎘污染修復的有效措施。