成都平原蠶豆高效根瘤菌的篩選及其促生功能初步評價

全紫曼，陳遠學，劉 明，彭 丹，蔣 帆，周 元，鄒 蘭，徐開未

（四川農業大學資源學院，四川成都 611130）

中國是最大的蠶豆生產國，干蠶豆產量占世界總產的36.7%[1]，是我國傳統對外貿易的重要農產品資源，出口量在雜糧中位居第二[2]。但近年由于生產成本較高，出口量持續萎縮[1]，因此如何提高蠶豆產量及效益是目前亟待解決的問題。研究表明，根瘤菌可為蠶豆提供生長所需80%的氮源[3]；接種根瘤菌能顯著提高蠶豆產量，增加土壤肥力[4-5]。Rugheim等[6]研究表明，接種根瘤菌還可提高蠶豆粗纖維和粗蛋白。可見，接種根瘤菌能有效提高蠶豆的產量及效益。豆科作物接種高效根瘤菌是國際上公認的一種有效生物固氮技術，且相較氮肥，以根瘤菌劑為代表的微生物肥料，成本低、利用率高、對環境無污染，符合發展綠色農業的要求[7]。

近年根瘤菌新功能拓展研究報道指出，少數根瘤菌除固氮外，還具有分泌吲哚乙酸(IAA)、溶磷等新的促生能力[8]。因此，本研究還對供試菌株的促生新功能如分泌IAA、溶磷能力進行初步探索，以期發現固氮效果和促生效果好的菌株，為該地區高效蠶豆根瘤菌劑的研制和應用提供科學依據，進而更好地推動根瘤菌劑的研制和應用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 來自本課題組前期初篩到的6株采集自成都平原且與‘大白蠶豆’高效匹配的蠶豆根瘤菌[15]。菌株編號、來源、土壤類型等信息詳見表1。

1.1.2 供試豆種 匹配性試驗供試品種為‘成胡14’和‘成胡15’，田間試驗供試品種‘成胡15’購自四川省農科院。

1.2 研究方法

1.2.1 匹配性試驗 (低氮雙層缽砂培法) 匹配性試驗培養裝置上層為裝有蛭石 (高壓滅菌2～4 h) 的塑料杯 (5 cm × 12 cm)，下層為低氮水培液 (高壓滅菌30 min)，用紗布條將上下兩層連接。蛭石量為杯高的3/4。低氮水培液配方 (氮含量0.005 g/L)：KCl 0.075 g、K2HPO40.136 g、MgSO40.06 g、Ca(NO3)20.03 g、CaSO40.46 g、檸檬酸鐵0.075 g、微量元素1 mL、蒸餾水1 L、pH 7.0。微量元素配方 (pH 7.0)：MnSO41.81 g、ZnSO40.22 g、CuSO4·5H2O 0.8 g、硼酸 2.86 g、鉬酸 0.02 g、蒸餾水1 L[18]。

表1 供試菌株基本信息Table 1 Basic information of tested strains

選種、種子催芽和播種方法，以及供試菌培養至對數生長期和接種方法參照Streit等[19]的方法。選兩個蠶豆品種顆粒大小、種皮顏色基本一致的健康種子，進行表面消毒，用無菌水浸泡種子過夜，28 ℃進行催芽，等種子長出胚根時，用無菌鑷子栽入雙層缽上層塑料杯的無菌蛭石中，每杯一株，分別接種6個菌株 (用酵母甘露醇液體于搖床28 ℃，120 r/min培養至對數生長期)，各蠶豆品種以不接菌為對照(CK)，各處理重復3次。在光照室 (控溫22～25 ℃，光照強度2800 lx左右，日照時間14 h) 培養41 d后收獲，定期補充無菌低氮營養液。收獲后測定植株干重和總瘤數。

1.2.2 大田接種試驗 田間試驗在成都崇州市榿泉鎮四川農業大學現代研發基地進行。土壤類型為簡育水耕人為土 (水稻土)，土壤基本養分狀況：pH 7.50，有機質22.8 g/kg，全氮1.31 g/kg，堿解氮104 mg/kg，有效磷18.6 mg/kg，速效鉀97.5 mg/kg。本試驗共設3個處理，接種根瘤菌SCAUf73、SCAUf76和不接種對照處理 (CK)，每個處理設3次重復，采用田間隨機區組排列。試驗于2016年10月至2017年4月進行。將制備好的根瘤菌菌劑 (活菌數5.0 × 108CFU/g以上，載體為泥炭) 與蠶豆 (成胡15) 拌種，其中不接菌處理也裹有不加菌液的滅菌泥炭，陰干后穴播，每窩3粒，定苗2株，小區面積10.8 m2，窩距30 cm，行距50 cm；播種時先播CK，以避免CK受接種根瘤菌的影響。管理按農戶種植蠶豆的常規管理執行。

在植株盛花期 (生育期105 d) 采樣，每個小區采集6株，測定株高、根瘤數、地上部分植株干重；收獲期 (生育期200 d，收獲鮮食蠶豆) 采樣，每個小區采集30株，測定飽莢數、癟莢數、植株干重、籽粒鮮產；對兩個時期植株樣品氮、磷、鉀含量測定[20]。在盛花期，通過BOX-PCR分子標記法對接種根瘤菌占瘤率進行測定，每個處理隨機選取45個根瘤，提取根瘤中類菌體根瘤菌DNA[21]，同時對接種菌株SCAUf73、SCAUf76總DNA進行提取[22]；然后對接種菌株和根瘤類菌體根瘤菌DNA進行BOX-PCR擴增[23]，比較接種菌株及相應根瘤類菌體根瘤菌DNA的BOX-PCR分子指紋圖譜，以此獲得供試接種菌株的田間占瘤率。

1.2.3 系統發育研究 采用GUTC法提取供試菌株(表1) 總 DNA[22]，然后分別用通用引物P1/P6、atpDF1/atpDR、recAF2/recAR2、GSII-5/GSII-6、nifHF1/nifHR1、nodC540/nodC1160[24-27]對其 16S rRNA基因、持家基因 (atpD、recA、glnII)、固氮基因nifH和結瘤基因nodC進行擴增。PCR擴增用Bio-Rad My CyclerTM儀器，PCR擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送成都擎科生物技術公司進行測序。測序結果分析方法及系統發育樹的構建同文獻[15]。

1.2.4 促生性測定 分泌生長素 (IAA) 的能力：采用比色法對供試菌株 (表1) 分泌IAA能力進行定性測定，根瘤菌用改良的剛果紅培養液培養[28]，取根瘤菌懸液 100 μL置于白色塑料比色板上，加 100 μL的比色液[28]，15 min后觀察顏色變化。粉紅色為陽性，表示菌株能夠分泌IAA，粉紅色顏色越深表示分泌IAA的能力越大；無色為陰性，表示菌株不能分泌IAA。在比色液中分別加入等量的10 mg/L(CK1)、30 mg/L(CK2)、50 mg/L(CK3) IAA作陽性對照進行粉紅色顏色深度的比較[28]。對顯色結果顯示的粉紅色深于CK1的菌株進行定量測定，測定方法同文獻[29]。

1.2.5 數據分析 采用Excel 2010整理試驗數據，采用IBM SPSS Statistics 19.0進行數據處理和方差分析。

溶磷能力：采用溶磷圈法對供試菌株 (表1) 溶磷能力進行定性測定。溶有機磷培養基用蒙金娜培養基[28]，其中水為蒸餾水，卵磷脂用75%的酒精加熱溶解，單獨滅菌，溫度降至70 ℃后與培養基混合；溶無機磷能力的測定用PKO培養基[28]，其中水為蒸餾水，3種無機磷源分別為磷酸鈣 [Ca3(PO4)2]、磷酸鋁 (AlPO4·2H2O)、磷酸鐵 (FePO4·2H2O)，均為市售分析純試劑，無機磷源均需過48 μm篩并單獨干熱滅菌后與培養基混合。

將供試菌株用點接法接種在預先配好的有機磷源為卵磷脂的蒙金娜培養基和三種無機磷源的PKO培養基上，以接種YMA培養基的處理為陽性對照，各處理重復3次，28 ℃培養7 d。7 d后觀察平板上菌株的生長狀況，對陽性對照菌落大小、各處理菌落大小及各處理菌落溶磷圈直徑進行記錄。

2 結果與分析

2.1 供試菌株與蠶豆品種的匹配性

從課題組前期初篩的與四川主栽品種‘大白蠶豆’高效匹配的6株蠶豆根瘤菌與成都平原主栽品種‘成胡14’、‘成胡15’的匹配性結果 (表2) 可知，‘成胡14’接種供試菌株后，除SCAUf60不能使其結瘤，其余5個菌株均能結瘤，每株結瘤量在1 8.3～3 0.7個，S C A U f 7 3結瘤能力最強；SCAUf70、SCAUf76、SCAUf73菌株能使‘成胡14’的植株干重顯著增加，分別比CK增加43.7%、43.2%、40.5%。6株供試根瘤菌與成胡15接種結果顯示，除SCAUf81以外，其他菌株均能使‘成胡15’結瘤，每株結瘤量在10.3～33.3個，SCAUf73結瘤能力最強；其中SCAUf76、SCAUf73、SCAUf57均能使‘成胡15’的植株干重顯著增加，分別比對照增加46.6%、61.6%、54.3%。由上可見，同一品種接種不同根瘤菌處理，其宿主蠶豆的長勢及結瘤能力不同；同一根瘤菌，接種不同蠶豆品種，其蠶豆長勢及結瘤能力可能存在較大差異。綜合兩個豆種的匹配性試驗以及課題組前期試驗結果，SCAUf76、SCAUf73與成都平原3個主栽蠶豆品種 (大白蠶豆、‘成胡 14’ 、‘成胡 15’ ) 都高效匹配，但還需要進行田間接種驗證。

表2 匹配性試驗中蠶豆盛花期植株干重和結瘤數Table 2 Dry weight and number of nodules of plants at flowering stage in the matching experiment

2.2 田間試驗結果

2.2.1 接種根瘤菌對蠶豆生長的影響 對前期篩選的2株與成都平原3個主栽品種匹配性好的菌株SCAUf73、SCAUf76進行田間驗證。與CK相比，根瘤菌SCAUf73、SCAUf76處理的植株干重盛花期略有增加，收獲期顯著增加，SCAUf73、SCAUf76分別比CK增加102%、154%。接種兩根瘤菌的處理，盛花期和收獲期的株高與CK差異都未達顯著水平 (P＜ 0.05)。處理SCAUf73、SCAUf76的根瘤數較多，占瘤率分別為33.3%、13.3%。在盛花期SCAUf73的結瘤能力、競爭結瘤能力均優于SCAUf76(表3)。

2.2.2 接種根瘤菌對蠶豆植株養分含量的影響 接種優良根瘤菌能有效地促進宿主植物對養分的吸收和積累 (表4、圖1)。在盛花期，SCAUf73、SCAUf76處理的植株全氮、全鉀含量及氮、磷、鉀積累量均高于CK，但差異均未達顯著水平。在收獲期，SCAUf73處理的植株全氮、全鉀含量較CK都有所增加，但差異不顯著；SCAUf76處理的植株全鉀含量較CK顯著增加23.5%，可見接種根瘤菌不僅能促進寄主植物對氮的吸收，還能促進對鉀的吸收，這與前人[30-31]研究結果較一致。在收獲期SCAUf76、SCAUf73處理的氮積累量分別較CK顯著增加151%、122%；磷積累量分別較CK顯著增加141%、91.4%；鉀積累量分別較CK顯著增加213%、132%。綜上所述，接種根瘤菌顯著增加了植株地上部養分的積累。

2.2.3 接種不同根瘤菌對蠶豆產量的影響 接種不同根瘤菌對蠶豆產量的影響存在顯著差異。表5顯示，接種SCAUf73處理蠶豆的籽粒鮮產比CK顯著增加25.0%，而接種SCAUf76處理對蠶豆的籽粒鮮產無明顯增加作用。接種根瘤菌SCAUf73、SCAUf76處理的單株結莢數、飽莢數較CK均無顯著差異，但SCAUf73處理均略高于CK，SCAUf76處理均略低于CK。

2.3 菌株SCAUf73系統發育分析

對田間篩選適合成都平原蠶豆生產接種的高效廣譜菌株SCAUf73進行系統發育分析。從16S rRNA基因系統發育樹 (圖2) 可知，SCAUf73為Rhizobium屬的菌株。三個持家基因atpD、recA和glnII序列聯合建樹 (圖3) 顯示，SCAUf73與R.sophoraeCCBAU 03386T相似度最高，為96.9%。一般多位點序列法進行的分類地位研究將97%相似性作為定種的標準[32]，可見，SCAUf73可能是Rhizobium的一個潛在新種菌株。

表3 接種根瘤菌對蠶豆生長及占瘤率的影響Table 3 Effects of rhizobia inoculants on faba bean growth and nodule occupancy

表4 接種根瘤菌對蠶豆植株氮、磷、鉀含量的影響 (%)Table 4 Effects of rhizobia inoculants on faba bean growth and total N, P and K contents in plant stems

圖1 接種根瘤菌SCAUf76和SCAUf3后盛花期和收獲期蠶豆植株氮、磷、鉀積累量Fig.1 N, P and K accumulation by faba bean plants inoculated with SCAUf76 and SCAUf3 strains at blooming stage and harvest stage

表5 接種根瘤菌對蠶豆產量的影響Table 5 Effects of rhizobia inoculants on yields of faba bean

圖4A顯示SCAUf73的nifH基因與R.anhuienseCCBAU 23252T相似度最高，相似度為96%。SCAUf73的nodC基因系統發育樹 (圖4B) 結果顯示，與R.leguminosarumUSDA 2370TnodC基因的相似性最高，相似度為95.7%。可見，SCAUf73菌株的共生基因具有特異性。

2.4 供試菌株促生性能測定

圖2 菌株SCAUf73的16S rRNA 基因系統發育樹Fig.2 16S rRNA phylogenitic tree of SCAUf73

圖3 菌株SCAUf73的recA-atpD-glnII序列聯合構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenitic tree of SCAUf73 concatenated byrecA-atpD-glnII

圖4 菌株 SCAUf73的共生基因nifH(A)、nodC(B) 系統發育樹Fig.4 Phylogenitic tree of SCAUf73 based on symbiotic genes ofnifH(A) andnodC(B)

對供試菌株分泌IAA的能力和溶磷能力進行了測定。結果 (表6) 顯示，6個供試菌株均有分泌IAA的能力。其中SCAUf60、SCAUf73、SCAUf81比色后顯示的粉紅色比CK1(10 mg/L IAA) 弱，表示分泌IAA的量都低于10 mg/L。處理SCAUf57、SCAUf70、SCAUf76比色結果顯示的粉紅色介于CK1及CK2之間，表明分泌IAA的量介于10～30 mg/L；SCAUf57、SCAUf70、SCAUf76分泌IAA的能力較強，因此對其進行定量檢測，結果表明其分泌IAA的量分別為19.7、17.3、21.0 mg/L。

表7表明，全部供試菌株均能在蒙金娜培養基上生長，除SCAUf60、SCAUf76處理長勢比陽性對照 (pH 7的YMA平板) 好，其他菌株與陽性對照直徑比值均≤ 1。菌株SCAUf60、SCAUf73、SCAUf 81在3種無機磷源 (磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵) 的PKO培養基均能生長，而SCAUf57、SCAUf70、SCAUf76僅能在2種無機磷源 (磷酸鈣、磷酸鋁) 的PKO培養基上生長；所有處理除SCAUf57、SCAUf60、SCAUf76、SCAUf81在磷酸鈣培養基上的長勢較陽性對照好外，其他所有處理菌株與陽性對照直徑比值均 ≤ 1。所有處理均未產生明顯的溶磷圈，溶磷圈直徑與菌落直徑相當。

3 討論

目前對根瘤菌的篩選主要經過三個步驟，首先用大量菌株針對宿主用水培或砂培法進行接種，篩選共生固氮效果好的菌株；其次，在溫室條件下，以目標地區土壤為介質復篩出固氮能力強、競爭結瘤能力強的復篩菌株；最后在目標地區進行田間試驗驗證后方可在其大區推廣[8,12]。由于成都平原地區蠶豆的主要種植土壤為水稻土，因此田間驗證試驗設在成都平原水稻土上進行。本試驗篩選得到一株高效廣譜根瘤菌SCAUf73，但占瘤率僅為33.3%，可能是由于試驗田土壤的全氮1.31 g/kg，堿解氮104 mg/kg，均達豐富水平[33]，土壤比較肥沃。有研究表明根瘤菌的接種效果在肥力越低的土壤中效果會越明顯[34]，因此SCAUf73在肥力較低的土壤中接種效果應更佳，占瘤率也應增加。目前國家正在實行雙減 (化肥與農藥減施) 政策，隨著政策的逐步實施，我國土壤的肥力，尤其是氮水平應該有所降低，因此SCAUf73在成都平原蠶豆生產中具有較好的應用前景。

表6 供試菌株分泌IAA的能力 (mg/L)Table 6 The ability to secrete IAA in the tested strains

表7 溶磷能力定性試驗Table 7 Qualitative test of phosphate solubilization ability

目前國內外對蠶豆高效根瘤菌篩選多數是與單個豆種進行匹配性研究[4-6]。伍惠等[17]對8株優良大豆根瘤菌與27種大豆品種進行匹配性研究，結果發現同一大豆品種的8個接種處理間根瘤數存在很大差異，差異大的可相差8倍，甚至菌株HH29接種對品種Willimus82的根瘤數為0，其他7個菌株接種Willimus82的根瘤數為每株23.5～85.8個。本試驗也發現，前期篩選得到的與大白蠶豆高效匹配的6株根瘤菌中，僅2株菌與成胡14、成胡15高效匹配，且其中SCAUf60不能使成胡14結瘤，SCAUf81不能使成胡15結瘤。這些結果說明，在進行根瘤菌優良菌株的篩選過程中，與當地多個主栽豆種的匹配性試驗是適用高效菌株篩選必不可少的環節。但將通過砂培 (或水培) 試驗初篩的優良菌株應用到田間，其效果可能存在很大差異。周濤等[30]通過水培試驗從分離自四川的75個大豆根瘤菌中篩選到6個與四川主栽大豆品種“貢選1號”高效匹配的菌株，運用到大田試驗中僅2株菌表現出良好的固氮效果。而本試驗對前期砂培初篩的與成胡15高效匹配的SCAUf76，在田間接種后卻對成胡15蠶豆無明顯增產作用。主要可能是由于砂培 (水培) 試驗條件較單一，影響因素較少，而土壤環境錯綜復雜，土著根瘤菌的競爭性強 (SCAUf76占瘤率僅為13.3%) 等因素都會影響其接種效果，且砂培 (水培) 試驗在溫室下的花期采樣，有研究表明某些根瘤菌的固氮效果主要在盛花期后期充分發揮[30]。由此可見，砂培(水培) 試驗篩選的高效根瘤菌還需要通過田間試驗進一步驗證。

某些根瘤菌固氮效果并不明顯，但其較強的促生能力依然能有效促進植株生長[28,35]。本試驗中SCAUf76，在收獲期植株的含氮量比CK略低，但植株干重比CK顯著增加154.3%，可能與SCAUf76具有較強分泌IAA的能力有關，它在所有供試菌中分泌IAA的能力最強，可達21.0 mg/L；該試驗植株接種根瘤菌的量約為9.3 × 107CFU/粒種子，植株的結瘤數僅為58.6個/株，由此可見接種的根瘤菌只有少部分能使植株形成根瘤，其他大部分作為根際促生菌分布于根際，而IAA能夠有效地促進植株的生長；還可能與該菌的溶鉀能力有關，有研究表明某些根瘤菌能夠促進植物對鉀的吸收[30-31]，SCAUf76處理在收獲期植株全鉀含量較CK顯著增加23.5%，但SCAUf76的溶鉀能力還有待進一步研究。

某些根瘤菌還具有溶磷能力，將植物難以吸收利用的磷轉化為可吸收利用的磷，對植物生長起著促進作用[28,35]。目前常用溶磷圈法測定菌株的溶磷能力，本試驗所有菌株均未產生明顯的溶磷圈。但有研究表明，某些在培養液中具有溶磷現象的溶磷菌在平板培養基上沒有產生明顯的溶磷圈，由此可見溶磷圈法僅能作為參考[36-37]。本研究發現菌株SCAUf57、SCAUf70、SCAUf76在磷源為磷酸鐵的培養基上不能生長，但能在其他2種磷源 (磷酸鋁、磷酸鈣) 的PKO培養基上生長良好，由此可以說明，菌株只要在用蒸餾水配制的溶磷培養基上生長較好，盡管溶磷圈不明顯，也可能具有溶磷能力。根瘤菌在PKO及蒙金娜培養基上長勢與陽性對照(YMA，pH 7.0) 的比值，可在一定程度上衡量菌株的溶磷能力。綜上所述，本研究全部菌株均能在有機磷培養基上生長，可能具有一定的溶有機磷能力；其中SCAUf60、SCAUf76在有機磷培養基上的長勢較陽性對照好，可能具有較好的溶有機磷能力；SCAUf57、SCAUf70、SCAUf76僅能在磷酸鈣、磷酸鋁培養基上生長，因此可能具有溶磷酸鈣、磷酸鋁的能力，不具有溶磷酸鐵的能力；SCAUf60、SCAUf73、SCAUf81處理均能在3種PKO培養基上生長，可能具有溶解磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵這3種無機磷的能力；其中SCAUf76、SCAUf57、SCAUf60、SCAUf81處理在含磷酸鈣的PKO培養基上的長勢比陽性對照好，可能具有較好溶解磷酸鈣的能力，但還需定量試驗進一步驗證。

4 結論

本研究篩選到一株與成都平原3個主栽品種均匹配且具有一定分泌IAA能力的菌株SCAUf73，能使蠶豆鮮籽粒顯著增產25.0%；多位點基因序列表明SCAUf73可能為快生根瘤菌屬 (Rhizobium) 的一個新類群，是成都平原蠶豆高效根瘤菌劑研制的優良菌株資源。