萬壽菊秸稈用于蘋果連作土壤生物修復材料的潛力

王曉芳，趙玉文，王 玫，王海燕，盛月凡，尹承苗，陳學森，毛志泉*

（1 作物生物學國家重點實驗室/山東農業大學園藝科學與工程學院，山東泰安 271018；2 山東省果樹研究所，山東泰安 271000）

蘋果連作障礙 (apple replant disease，ARD) 在全世界蘋果主產區普遍發生，連作使得蘋果園土壤生態環境惡化，果實產量和品質下降，影響蘋果產業的可持續發展和食品安全[1]。蘋果連作障礙的致病因素復雜，但越來越多的研究表明土傳病蟲害是導致連作障礙的主要原因。Van等[2]研究發現，在南非連作蘋果園中土壤有害真菌鐮孢屬、柱孢屬及腐霉屬是引起連作障礙的主要原因；Tewoldemedhin等[3]從連作蘋果園腐爛的根中分離到大量的尖孢鐮孢菌。但導致連作障礙的因素在不同地區甚至同一地區不同果園也會不同，給連作障礙的防控帶來較大困難[4-5]。我國農藥使用量持續增加與土傳病害的頻繁發生密切相關，實現農藥使用量零增長，甚至負增長目標，首先必須控制作物土傳病害的農藥使用量[6]。因此尋求有效的農藥替代技術就十分迫切和必要，生物消毒即是在這樣的背景下被人們逐漸認識和利用的。

生物消毒對環境無污染，對植物無藥害，同時又可以改善土壤肥力，被看作是很有前景的一項甲基溴替代技術。生物消毒一般包括3個步驟：首先，將易分解的有機材料與土壤混勻，然后灌水，最后用塑料膜進行覆蓋，其作用機理是誘導土壤形成強還原性的環境來抑制病原微生物[7]。這種生物消毒的方法不僅能夠減輕生態和環境風險，有效避免對土壤微生物的不利擾動，同時被證明在抑制多種土傳病原菌上有良好的效果，從而提高作物產量[8-11]。近年來關于利用蕓薹屬植物生物消毒防治土傳病蟲害的報道較多，在蘋果方面也有報道，但利用其它植物生物消毒的報道較少。

萬壽菊 (Tagetes erecta) 常用于園林綠化，還可以提取色素，吸收土壤中的重金屬鎘，提取殺蟲殺菌劑等[12]。近年來萬壽菊在很多地方的扶貧開發和農業產業結構調整中，升級到了產業化開發種植的行列。范志宏等[13]研究表明，萬壽菊根提取物對西瓜枯萎病菌有明顯的抑制作用，其中以精油類的抑菌效果最好，且能促進植株生長，有效減輕了西瓜枯萎病菌對植株的毒害作用。萬壽菊花采收后剩下的秸稈在生產上利用困難，成為突出的農業環境治理難題，如何綜合利用萬壽菊生產過程中產生的大量秸稈未見相關報道[14]。雖然萬壽菊具有明顯的殺菌作用，但利用萬壽菊秸稈生物消毒防控蘋果連作障礙未見報道。為尋求緩解或克服蘋果連作障礙的有效方法，本研究將土壤生物消毒的方法應用到蘋果上，以蘋果砧木平邑甜茶為試材，探討不同添加量萬壽菊秸稈粉碎物對其生長及連作土壤微生物的影響，系統性地評估生物消毒的方法對蘋果連作障礙的綜合防控效果，以期為合理利用萬壽菊秸稈和減輕蘋果連作障礙提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 供試土壤和材料

試驗于2016年10月—2017年10月在山東農業大學園藝科學與工程學院、國家蘋果工程技術研究中心及作物生物學國家重點實驗室進行。

供試土壤為棕壤，取自山東省泰安市滿莊鎮小王莊村26年生紅富士蘋果園。土壤硝態氮含量5.5 mg/kg、銨態氮含量3.8 mg/kg、速效鉀90.6 mg/kg、有效磷9.3 mg/kg、有機質含量5.3 g/kg、pH值6.1。自距樹干80 cm處，去表層土后，取10—40 cm深的區域 (根系集中分布區，取根部土壤能較好模擬重茬狀態)，多點隨機取樣，混勻備用。

供試材料為平邑甜茶 (Malus hupehensisRehd.) 實生苗。將平邑甜茶種子于4℃層積30 天左右，待種子露白后，播種于育苗基質中，幼苗長至6片真葉時選取長勢一致、無病蟲害植株栽植。

供試萬壽菊材料 (Tagetes erecta) 于2016年10月取自山東省濟寧市嘉祥縣老僧堂鎮，為當年生萬壽菊殘株，包括萬壽菊秸稈、葉及少量花。全株自然風干，采用粉碎機粉碎，裝袋運回泰安，布置盆栽試驗前取一部分過3 mm孔徑篩，裝入封口袋中備用。

1.2 試驗處理

試驗設置5個處理，設4個萬壽菊秸稈粉添加量 (0、12.0、30.0、60.0 g/kg)，秸稈粉與土壤拌勻，均覆蓋薄膜。同時追加一個不添加萬壽菊粉也不覆膜的對照 (CK)。2017年3月25日進行處理，在每個盆盆底放置濾紙，將不同添加量的萬壽菊與連作土拌勻后填盆，然后澆透水，覆膜。處理15天后，揭膜晾7天栽植平邑甜茶幼苗。選取長勢一致、無病蟲害的 6 葉幼苗移栽到裝有6.0 kg土的泥盆中 (盆上口內徑23 cm，高18 cm)。每處理20 盆，每盆 2株幼苗，隨機排列，正常肥水管理。

1.3 測定指標及方法

生長指標測定：7月10日、8月10日、9月10日分3次取樣，每個處理取平邑甜茶幼苗3株，洗凈后測定其生物量指標。株高、地徑、地上部鮮重采用常規方法測定，葉綠素含量使用SPAD-502型葉綠素計 (Konica Minolta，Japan) 測定。

根系呼吸速率測定：于8月10日取幼苗根系上的新鮮白根，采用Oxytherm氧電極 (Hansatech公司，英國) 測定根系呼吸速率，參照毛志泉等[15]的方法。

光合參數測定：2017年8月20日 (晴天)，上午9—11時用CIRAS-3便攜式光合儀 (PP Systems，英國，葉室窗口尺寸 25 mm × 18 mm) 測定平邑甜茶幼苗葉片的凈光合速率 (Pn)、氣孔導度 (Gs)、蒸騰速率 (Tr) 和胞間CO2濃度 (Ci)，計算水分利用效率(WUE)，WUE = Pn/Tr。每處理隨機測定3株，每株測定成熟功能葉 (從上往下數第3～5片葉)，3次重復。控制光強 (1000 ± 50) μmol/(m2·s)，CO2濃度(360 ± 20) μL/L，溫度 (26 ± 1)℃[16]。

根保護性酶活性的測定：超氧化物歧化酶(SOD) 活性采用氮藍四唑 (NBT) 光還原法測定[17]；過氧化物酶 (POD) 活性測定按Omran[18]的方法；過氧化氫酶 (CAT) 活性按照趙世杰[19]的方法。

土壤微生物數量測定：細菌、真菌、放線菌均用稀釋平板法測定，測定前計算水分系數。細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基，真菌采用馬丁氏培養基，放線菌采用高氏一號培養基[20]。

土壤中尖孢鐮刀菌基因拷貝數測定：取0.5 g過篩的新鮮土壤，按E.Z.N.A.?土壤DNA提取試劑盒提取DNA。采用實時熒光定量CFX ConnectTMReal-Time System (Bio-Rad，美國) 對土壤中尖孢鐮孢菌基因拷貝數進行實時熒光定量分析。實時熒光定量PCR體系依據SYBR Premix Ex Taq TMKit Ta Ka Ra試劑盒說明步驟完成。25 μL PCR反應體系：DNA 模板 1.5 μL，SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，引物各1 μL，dd H2O 9 μL。尖孢鐮孢菌PCR擴增反應程序：95℃預變性30 s，94℃變性5 s，60℃退火，72℃延伸30 s，共計40個循環[21]。

末端限制性片段長度多態性 (terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP) 技術分析：提取土壤總DNA后，用真菌ITS區通用片段引物(ITS1-F和ITS4) 進行擴增，用限制性內切酶Hha I對PCR產物酶切，將酶切產物送至生工生物工程(上海) 股份公司進行測序，采用SPSS 19.0軟件對測序結果進行真菌群落聚類分析和主成分分析[22]。

1.4 數據分析

試驗數據采用Microsoft Excel 2003進行數據整理，SPSS 19.0軟件進行方差和顯著性檢測分析。

2 結果與分析

2.1 萬壽菊生物消毒對平邑甜茶幼苗生長的影響

添加萬壽菊秸稈粉均能明顯提高連作條件下平邑甜茶幼苗的生物量，3次取樣結果均與CK、0添加量處理的差異顯著(表1)。以7月取樣測定結果為例，與不添加菊粉處理相比，12 g/kg添加量的株高、地徑、地上部鮮重、葉綠素含量分別提高69.4%、6.3%、81.5%、8.2%；30 g/kg添加量的分別提高了183.3%、55.5%、221.5%、17.3%，增加幅度最大；60 g/kg添加量的分別增加55.6%、32.1%、119.5%、10.9%。30 g/kg添加量與12 g/kg、60 g/kg添加量間各指標差異顯著，12 g/kg與60 g/kg添加量間差異較小。

表1 不同萬壽菊粉用量下平邑甜茶幼苗生長及葉片葉綠素相對含量Table 1 Growth and SPAD values ofMalus hupehensisRehd.seedlings under different marigold powder addition treatments

2.2 萬壽菊生物消毒對平邑甜茶幼苗光合參數的影響

測定光合參數時，CK幼苗長勢弱，葉片太小，未充滿整個測量室，未進行光合參數測定。圖1表明，添加萬壽菊秸稈粉均提高了平邑甜茶幼苗的葉片凈光合速率 (Pn)。與0添加量處理相比，30 g/kg處理的Pn提高了83.6%，12 g/kg和60 g/kg處理的分別提高了25.2%和49.6%，各處理間均差異顯著。各處理的氣孔導度 (Gs)和蒸騰速率 (Tr)變化趨勢同葉片凈光合速率，30 g/kg處理與12 g/kg、60 g/kg處理間差異顯著，12 g/kg與60 g/kg處理間差異不明顯。水分利用效率處理間差異顯著，與0添加量處理處理相比，30 g/kg處理的高57.1%，12 g/kg和60 g/kg處理的高16.1%、38.0%。胞間CO2濃度(Ci)各處理間無顯著差異。

2.3 萬壽菊生物消毒對平邑甜茶幼苗根系呼吸速率的影響

萬壽菊秸稈粉處理均能提高平邑甜茶幼苗的根系呼吸速率，與0添加量處理相比，添加萬壽菊粉12、30、60 g/kg處理的分別提高了23.4%、56.6%、33.6%，均達到顯著性差異。其中30 g/kg添加量處理的增加幅度最大，效果最明顯，與12 g/kg、60 g/kg添加量處理間差異顯著，12 g/kg與60 g/kg添加量處理間無明顯差異(圖2)。

2.4 萬壽菊生物消毒對平邑甜茶幼苗葉片保護性酶活性的影響

不同萬壽菊生物消毒處理對平邑甜茶幼苗根系的SOD活性影響大小不一，但與0添加量處理的均達到顯著差異(圖3)。其中以添加萬壽菊粉30 g/kg處理的SOD活性最高，比0添加量處理的提高48.7%；其次為60 g/kg、12 g/kg處理，分別比0添加量處理的提高36.4%、15.4%，各處理間差異顯著。POD和CAT活性變化與SOD變化趨勢一致，均表現為30 g/kg的活性最高，比0添加量處理的分別提高113.5%、115.2%。

2.5 萬壽菊生物消毒對 土壤微生物數量的影響

與0添加量處理相比，連作土壤中添加萬壽菊后，各處理土壤均表現為真菌數量減少，細菌數量增加，細菌/真菌比值變大(表2)。添加萬壽菊粉12、30、60 g/kg處理的細菌/真菌比值分別是99.3、265.7、197.3，分別是0添加量處理的1.4、3.7、2.7倍，以添加萬壽菊粉30 g/kg處理的差異最大，其次是添加萬壽菊粉60 g/kg處理，添加萬壽菊粉12 g/kg的比值最小，但均與0添加量處理的差異顯著，各添加量處理間也差異明顯。

圖1 不同萬壽菊粉添加處理下平邑甜茶幼苗葉片的光合效率Fig.1 Photosynthetic efficiencies of leaves ofMalus hupehensisseedlings under different marigold powder addition rates

圖2 不同萬壽菊粉添加處理下平邑甜茶幼苗的根系呼吸速率Fig.2 Root respiration rate ofMalus hupehensisRehd.seedlings under different marigold powder addition

2.6 萬壽菊生物消毒對土壤中尖孢鐮刀菌基因拷貝數的影響

采用實時熒光定量PCR分析了不同處理土壤中的尖孢鐮孢菌基因拷貝數。萬壽菊生物消毒處理均顯著降低了土壤中尖孢鐮孢菌的基因拷貝數(圖4)。與0添加量處理相比，添加萬壽菊秸稈粉12 g/kg、30 g/kg、60 g/kg處理分別降低了18.6%、57.1%、40.4%，以添加30 g/kg處理的下降幅度最大，且各處理間差異顯著。說明萬壽菊生物消毒處理后連作土壤中尖孢鐮孢菌為主的有害真菌數量明顯減少。

2.7 萬壽菊生物消毒對連作土壤真菌的T-RFLP分析

圖3 不同萬壽菊粉添加處理下平邑甜茶幼苗葉片的保護性酶活性Fig.3 Protective enzyme activity in leaves ofMalus hupehensisseedlings under different marigold powder addition

表2 不同萬壽菊粉添加處理下土壤的微生物數量Table 2 Population of soil microorganisms in soils under different marigold powder addition

圖4 不同萬壽菊粉添加處理下土壤尖孢鐮孢菌的實時熒光定量分析Fig.4 Real-time quantitative analysis of soilFusarium oxysporumunder different marigold powder addition

圖5 不同萬壽菊粉添加處理間 T-RFLP 圖譜的主成分分析Fig.5 Principle component analysis for T-RFLP patterns under different marigold powder addition rates

由主成分分析 (圖5) 和聚類分析 (圖6) 可以看出，萬壽菊生物消毒對蘋果連作土真菌群落結構的響不同。主成分分析結果顯示，第一主成分方差貢獻率為86.4%，第二主成分方差貢獻率為12.8%，兩者貢獻之和為99.2%，可以代表整個土壤系統的狀況。聚類分析可以看出，不同添加量萬壽菊生物消毒處理后的真菌群落結構與連作土對照 (CK) 有明顯差異，其中12 g/kg處理和0添加量處理的真菌群落結構相近，添加30 g/kg處理的與添加60 g/kg處理的相近。

3 討論

圖6 不同萬壽菊粉添加處理間 T-RFLP 圖譜的聚類分析Fig.6 Cluster analysis of T-RFLP patterns of different marigold powder addition treatments

長期連作會導致土壤的理化和生物特性發生變化[23]，土壤微生物區系也發生明顯變化，主要表現為土壤微生物種群結構、數量以及比例失調，土傳病害加重，某些病原菌微生物數量急劇增加，有益微生物大大減少，打破了原有的根際微生態平衡[24]。株高降低、葉面積減小、葉綠素含量降低、光合速率下降等是作物對連作的負反饋[25]。生物消毒 (BSD)處理能促進作物生長、穩產、增產，主要是對土傳病蟲害的防控作用，其次是改善土壤其他環境因素等[26]。Shrestha等[27]運用Meta-Analysis分析方法，對123份關于生物消毒對作物產量影響的文獻進行分析表明，與對照相比，所有BSD處理均能顯著提高作物產量。Butler等[28]以糖蜜作為碳源，發現生物消毒處理能確保辣椒 (Capsicum annuum) 和茄子(Solanum melongena) 的產量等于或大于溴甲烷的化學熏蒸消毒。本研究中，萬壽菊生物消毒連作土使栽植的平邑甜茶幼苗生物量明顯增加，與Mazzola等[9]使用芥菜生物消毒的研究結果一致。說明適量萬壽菊生物消毒處理可增強根系長勢及抗性，進而促進植株生長發育。同時試驗中發現萬壽菊施用濃度并非越大越好，添加萬壽菊粉60 g/kg處理連作土壤后幼苗生長指標不如添加萬壽菊粉30 g/kg處理，可能是因為萬壽菊植株殘體含有化感物質，過量施用可能會對根系生長和有益生物產生抑制作用；連作土只做覆膜處理也可促進植株生長，但效果不明顯。

有研究表明，在一定范圍內光合速率隨葉綠素含量的增加而增大[29]。逆境脅迫可破壞葉綠體和類囊體膜結構，降低葉綠素合成，抑制光合速率[16]。王志強[30]在桃連作上的研究發現，桃樹體生長健壯可以明顯抵抗重茬障礙對植株的脅迫作用。本研究也發現萬壽菊生物消毒處理的平邑甜茶幼苗生長健壯，葉色深綠，葉片大，葉片相對葉綠素含量明顯高于連作土栽植的苗木，凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、水分利用效率等指標都大幅度得到改善 (連作土對照植株長勢弱，葉片發黃，葉片小，無法測定光合參數)。研究發現，植株光合速率增加會促進植株生長，水分利用效率提高，可減輕逆境脅迫對葉綠體和類囊體膜結構的破壞，增強抵御逆境的能力。

植物根系是地下部代謝的中心，對根系更新、養分的吸收以及植株生長發育具有重要意義。根系呼吸速率的強弱是植物根系功能和抵御逆境脅迫的重要指標之一[31]。POD、CAT、SOD是保護酶系統的主要酶，在植物遭受逆境時可通過清除活性氧等自由基來減輕對植物細胞膜的傷害作用，是植物抵抗逆境的第一道防線[32]。本研究中，萬壽菊生物消毒處理不同程度地提高平邑甜茶幼苗的根系呼吸速率，同時明顯提高根系的SOD、POD和CAT活性，從而提高平邑甜茶幼苗抗逆性來緩解連作障礙對植株的脅迫。結合前人研究[12,33-34]分析，一方面萬壽菊具有較強抑菌作用，能較好地抑制土壤病原菌，另一方面施入適量萬壽菊能改善土壤環境，有利于提高根系的生理功能和吸收功能。

Wu等[35]研究發現長期連作導致土壤瘠薄、香草莖枯萎病的爆發，主要是因為有益微生物的減少和病原真菌的增加。楊永等[36]研究發現長期連作導致哈密瓜土傳真菌病害大面積發生，微生物肥料的施用可為防治土傳真菌病害發揮積極作用。本研究發現，萬壽菊生物消毒顯著改變了連作土壤的土壤微生物群落結構，使真菌減少、細菌增加，微生物環境優化，有利于根系生長發育和植株生長。萬壽菊生物消毒處理后的土壤真菌群落結構均與連作土對照完全分開，萬壽菊粉0添加量處理與12 g/kg添加量處理的聚類在一起，可能是因為低濃度的萬壽菊處理效果尚不明顯，因此與單獨覆膜處理的菌落結構差異不大。添加萬壽菊粉30 g/kg和60 g/kg處理的聚類在一起，說明適宜量的萬壽菊即可改變真菌結構，過量施用對菌落結構影響不大。萬壽菊生物消毒處理的有害真菌尖孢鐮孢菌基因拷貝數明顯降低，這與Manici[37]的研究結果類似，其研究發現再植蘋果幼樹前在連作土中種植萬壽菊可明顯增加土壤中的非致病性真菌，減少有害真菌，從而促進蘋果幼樹生長。劉星等[38]采用有機物料添加、土壤灌水和表土覆蓋相結合的土壤生物消毒方法處理馬鈴薯連作土壤，發現處理后的連作土中真菌和鐮孢菌數量大幅下降。高青海等[39]在研究甜瓜連作障礙問題時也有類似結果，使用秸稈還田有效調節了設施薄皮甜瓜根區土壤微生物區系，改善了土壤微生態環境，從而達到減輕甚至克服連作障礙的目的。

4 結論

盆栽條件下，添加適宜量的萬壽菊秸稈粉碎物(30 g/kg) 對連作土進行生物消毒可明顯提高平邑甜茶幼苗的生物量，調節根際環境，減少有害真菌尖孢鐮孢菌的基因拷貝數，改變土壤微生物群落結構，可作為蘋果連作障礙的防控措施。下一步關于萬壽菊生物消毒對連作土壤真菌、細菌的影響需要結合高通量測序等方法進行深入研究，也為萬壽菊在生產中的應用提供理論依據。