美國山核桃組織培養研究

張文學 印邁 續晨 賁愛玲 蔡小寧

摘? 要：以美國薄殼山核桃嫩莖為外植體，研究了硝態氮和不同外源激素組合對其芽誘導和生長的影響。結果表明，硝態氮為美國薄殼山核桃組織培養所必需的，較高含量的細胞分裂素有利于芽的誘導和生長，硝態氮和細胞分裂素BA可增加愈傷組織的數量;適合的芽誘導培養基配方為1/2 B5+NAA 0.1mg/L+BA 2.0mg/L。

關鍵詞：美國山核桃;組織培養;基本培養基;硝態氮

中圖分類號? S79文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）11-0022-2

美國山核桃（Carya illinoensis），又名薄殼山核桃、美國薄殼山核桃、碧根果，其果實是一種老少咸宜的堅果食品，深受消費者的歡迎;因其木質堅硬，在家具制作和軍工等方面也有一定的應用。開展組織培養技術的研究，可以加快繁殖，更快地推廣應用，同時也可以為育種研究提供新的途徑。當前，國內外有一些對美國山核桃組織培養的報道[1-4]，但仍然存在諸多問題，需要從更多方面開展研究。為此，筆者開展了基本培養基的硝態氮和外源生長素、細胞分裂素組合對美國薄殼山核桃芽的誘導和生長的影響研究。

1 材料與方法

1.1 材料 美國薄殼山核桃嫩莖。

1.2 培育種子苗 選取大小相對一致的碧根果種子，用37℃自來水浸泡7d左右。待種殼裂開移至沙盆，在28℃恒溫培養箱中催芽，在較濕潤的條件下培養14d左右，待裂口處伸出白色小芽，然后在裝有田間土壤的花盆里播種，3～4d左右小芽出土。

1.3 消毒滅菌 從野外大樹上摘取嫩枝，修剪至適當大小后放進燒杯，在自來水下沖洗干凈，備用。消毒時先用70%的酒精浸泡20s，倒掉酒精，立即加入滅菌劑。共設置4個處理，分別為：0.1%升汞滅菌5min;0.1%升汞滅菌10min;0.1%升汞滅菌15min;84消毒液滅菌10min。滅菌時間到了后，倒掉滅菌劑，用無菌水沖洗4次，接種于改良WPM添加BA0.5mg/L的培養基上，置25℃，光照時間12h，黑暗時間12h周期下培養。7d后統計外植體污染發生的情況，并將未受動污染的外植體轉接到新鮮的培養基上，14d后觀察嫩枝外植體存活的情況。

1.4 培養基 基本培養基成分為改良WPM、1/2B5和增減硝態氮，添加不同數量的生長素和細胞分裂素。以上培養基均添加30g/L的蔗糖，用5.6g/L的瓊脂粉固化培養基，在滅菌前調整pH至5.9左右，培養基配好后在高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，121℃保持20min。

1.5 培養室培養條件 培養溫度25℃，光照時間12h，黑暗時間12h，如此光暗交替輪換。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方法對外植體滅菌效果的影響 從表1可知，0.1%升汞滅菌效果好于84消毒液;用0.1%升汞滅菌，隨著浸泡外植體的時間加長，滅菌效果越來越好。0.1%升汞滅菌15min的處理雖然滅菌效果最好，但是對薄殼山核桃嫩枝的傷害也最大;既能有較好的滅菌效果，傷害也較小的處理為0.1%升汞滅菌10min。另外，也可以看出，取自野外大樹上的嫩枝外植體帶菌嚴重，公認最強的滅菌劑升汞的滅菌效果也難以達到理想狀態。考慮到野外獲取的薄殼山核桃外植體帶菌現象嚴重，后面的試驗從種子直接萌發長大成幼苗，再剪取幼芽，用作組織培養的外植體材料。

2.2 硝態氮和不同外源激素組合對芽誘導和生長的影響 設計了4種不同的培養基配方，1號培養基為1/2B5基本成分+NAA0.1mg/L+BA2.0mg/L;2號培養基為1/2B5基本成分減去硝酸鉀+NAA0.1mg/L+BA2.0mg/L;3號培養基為1/2B5基本成分+NAA0.1mg/L;4號培養基為1/2B5基本成分減去硝酸鉀+NAA0.1mg/L。上述培養基中都添加了30g/L的蔗糖，用5.6g/L的瓊脂粉固化培養基，在培養基滅菌前調整pH為5.8～6.0。從表2可見，芽誘導率最高的是1號培養基，達到100%，其他幾種配方差不多。比較1號和2號培養基配方可知，硝酸鉀對于芽的誘導是有利的，去除以后，芽的誘導率明顯下降。在只添加低濃度的萘乙酸時，是否去除硝酸鉀對芽的誘導率影響不大。

從表3可知，薄殼山核桃組培苗的生長需要在培養基中加入一定的細胞分裂素，而且硝態氮也不應缺少。添加BA2.0mg/L同時再添加NAA0.1mg/L，其試管苗的高度優于只添加NAA0.1mg/L的處理，褐化率明顯減輕;添加硝酸鉀的處理，其試管苗的高度優于減掉硝酸鉀的處理，且褐化率明顯減輕。此外，產生愈傷組織的多少跟是否添加細胞分裂素和是否減去硝酸鉀有關，添加細胞分裂素BA的處理，產生的愈傷組織較多;減去硝酸鉀的處理愈傷組織較少。

3 討論

其他研究者在美國薄殼山核桃的組織培養中曾經選用MS、WPM、DKW基本培養基[1-5]，未見采用B5基本培養基的文獻報道。由本次研究結果表明，1/2 B5基本培養基也可以用于美國薄殼山核桃的組織培養。

在前期的試驗中，筆者采用MS基本培養基添加不同組合的激素，效果不佳，后改用改良WPM培養基取得了一定進展。考慮到MS基本培養基具有較高含量的硝態氮和銨態氮，可能是試驗結果不佳的原因，因而又進一步嘗試了1/2 B5基本培養基，此基本培養基的特點是含有很低量的銨態氮和比MS基本培養基適當降低含量的硝態氮。實驗證明，將1/2B5基本培養基中硝態氮去除，明顯不利于芽的誘導和愈傷組織生長。如果將銨態氮去除會發生什么情況，今后有待于進一步研究。

此外，培養基中的細胞分裂素含量與生長素含量比例也很重要，較高比例的細胞分裂素含量顯然有利于美國山核桃芽的誘導和生長。在另外的試驗中，我們曾經將NAA含量由0.1mg/L提高到0.5mg/L，BA含量維持在2.0mg/L，結果繼代培養的試管苗均褐化死亡，說明NAA含量不宜過高，或許NAA含量可以更低甚至為0，這有待于后續實驗證實。

參考文獻

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（責編：張宏民）