杜氏鹽藻無菌化處理及其對生長的影響

王玲玲 劉曉燕 馬貴范 王吝安

摘? 要：采用藥敏試驗法、抗生素除菌法、帶菌株與無菌株生長比較法，研究了鹽藻中雜菌對不同抗生素的敏感性、不同抗生素對鹽藻藻株生長的影響、抗生素對鹽藻的無菌化處理方式、無菌株和帶菌株生長曲線變化。結果表明：200μg·mL-1氨芐青霉素、50μg·mL-1頭孢呋辛、400μg·mL-1慶大霉素3種抗生素聯合逐次使用，可實現鹽藻藻株的無菌化處理，且對藻株生長的影響不顯著（P>0.05）;帶菌鹽藻與無菌鹽藻在延滯期和指數生長期細胞密度差異不顯著，穩定期后無菌藻可以保持較長一段時間的穩定生長，但帶菌鹽藻細胞密度下降，易下沉老化。

關鍵詞：杜氏鹽藻;無菌化;抗生素;比生長率;細胞密度

中圖分類號 Q943.1文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）11-0017-5

Abstract：Sensitivity test，antibiotic sterilization and comparison of non-axenic strain and axenic strain growth were used to investigate the susceptibility of hybrid bacteria in Dunaliella salina to different antibiotics，the effect of different antibiotics on the growth of Dunaliella salina strains，the axenation of Dunaliella salina by antibiotics，and the changes in growth curve of non-axenic strains and axenic strains. The results showed that the axenation of Dunaliella salina strains could be achieved by successive use of 200 μg·mL-1 ampicillin，50 μg·mL-1 cefuroxime and 400 μg·mL-1gentamicin，and its effect on the growth of Dunaliella salina strains was not significant. No significant difference was found in the lag phase and exponential phase between non-axenic strains and axenic strains. After the stationary phase，the axenic strains kept the cell density for a period of time，but the cell density of non-axenic strains decreased and were prone to aging.

Key words：Dunaliella salina;Axenation;Antibiotics;growth rate;Cell density

杜氏鹽藻（Dunaliella salina）富含蛋白質、天然胡蘿卜素等具有特殊生物活性的物質，是目前公認的具有獨特經濟價值的微藻[1]。鹽藻的無菌純種是研究鹽藻生理生態學、分子學等的基礎，也是進行遺傳工程、鹽藻資源開發的關鍵[2]。在培養過程中，由于藻種常伴有雜菌，而無法準確開展藻-菌相互作用、兼養異養等方面的研究[3]。抗生素可抑制細菌的繁殖，在除菌抑菌方面表現出了強大作用。為此，筆者以抗生素為除菌工具，在實驗室條件下[4]研究了不同抗生素對杜氏鹽藻無菌處理效果及其對鹽藻生長的影響，并獲得了無菌杜氏鹽藻株系，以期為開展鹽藻大規模異養奠定基礎。

1 材料

1.1 藻種來源 實驗用鹽藻篩選分離于山東省榮成市桑溝灣自然水域，經分子鑒定為杜氏鹽藻。

1.2 培養基 鹽藻培養基采用f/2培養基[5]：其中NaNO3 74.8mg、NaH2PO44.4mg、NaSiO310.0mg、“f/2”微量元素溶液1mL、“f/2”維生素溶液配方1mL，過濾海水1000mL，鹽度60‰、pH為8.0、121℃、0.11MPa滅菌20min待用。細菌培養基采用牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、瓊脂15～20g、純水1000mL、pH為7.5;121℃、121℃、0.11MPa條件下滅菌20min待用。

1.3 主要試劑 化學試劑硝酸鈉、磷酸二氫鈉等分析純試劑，天津科密歐化學試劑有限公司生產;氨芐青霉素、頭孢呋辛、麥迪霉素等藥敏紙片（執行標準：WS/T125-1999）杭州天和微生物有限公司生產;萬古霉素等抗生素購自Sigma公司，參照薩姆布魯克等[6]法配制抗生素母液，配制的抗生素母液，用0.22μm的玻璃纖維濾膜過濾除菌。

1.4 主要儀器 智能光照培養箱（型號為KGHP-160/E），購自上海百典儀器設備有限公司;電子天平（型號為BS2202S），購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司;高壓蒸氣滅菌鍋（型號為XFH-50CA），購自浙江新豐醫療器械有限公司;可見分光光度計（型號為V-1200），購自翱藝儀器（上海）有限公司。

2 方法

2.1 鹽藻培養條件 光照培養箱中培養，設置溫度26℃，光暗比12h∶12h，光照強度3000～4000lx，每天振蕩2次。

2.2 藻液中細菌對抗生素的敏感性檢測 取對數生長期的藻液，1∶10接種到牛肉膏蛋白胨液體細菌培養基中，置于30℃培養箱中進行細菌擴大培。24h后吸取該藻液10μL，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養基表面，采用藥敏試驗法檢測藻液中細菌對氨芐青霉素、頭孢呋辛、麥迪霉素、萬古霉素、多黏霉素B、氯霉素、慶大霉素、硫酸鏈霉素、強力霉素和克林霉素10種抗生素的敏感性，每個平板上平貼2個濾紙片，每組設置3個平行平板，30℃培養箱中培養1d，記錄抑菌圈的大小，選擇抑菌圈大于30mm的抗生素作為除菌工具。

2.3 鹽藻對不同抗生素及濃度的敏感性檢測 根據藥敏試驗結果，取抑菌效果較為理想的氯霉素、氨芐青霉素、慶大霉素和頭孢呋辛4種抗生素母液按照一定體積加入到150mL鹽藻藻液中，使其終質量濃度分別為50、100，200、400μg·mL-1，每組設置3個平行，以未加抗生素的微藻作為對照，培養條件如2.1，培養9d。每天定時記錄鹽藻的生長密度。

2.4 抗生素單一和聯合除菌試驗 根據藻液中細菌對抗生素的敏感性和鹽藻對不同抗生素及濃度的敏感性實驗結果，選取慶大霉素、氨芐青霉素、頭孢呋辛3種抗生素按照表1中9種方案對鹽藻進行除菌試驗，培養條件如2.1，培養9d，每天定時記錄鹽藻的生長密度;以未加抗生素的鹽藻藻液為對照組。

2.5 無菌檢測 分別取2.4試驗中經過抗生素除菌處理的鹽藻藻液10μL涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養基表面，置于30℃培養箱中培養1d，觀察有無細菌生長。初步認定無菌后，再經3次傳代培養（按1∶10的接種量培養于150mL的三角瓶中，每代培養9d），培養條件同2.1，徹底消除殘留抗生素影響。再取各組藻液10μL涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養基表面，置于30℃培養箱中培養1d，觀察有無細菌生長。

2.6 自然帶菌藻和無菌鹽藻生長曲線比較 取對數生長期的帶菌和無菌藻液，接種于150mL的f/2培養基中，接種初始密度均為0.5×106個·mL-1，培養28d，每天定時記錄鹽藻細胞密度。取樣時均遵循無菌操作規則。

2.7 生長情況測定方法

2.7.1 細胞密度的測定 用血球計數板計數鹽藻細胞密度，再使用V-1200分光光度計測定相應細胞濃度下的藻液OD630值，繪制吸光度與藻細胞密度的標準曲線。每天測定實驗藻液的OD630值，根據標準曲線計算出對應的細胞密度，每個樣計3次，取平均數。

2.7.2 比生長速率測定 比生長速率μ=（lnNt-lnN0）/T，其中Nt為培養t天時的細胞數，N0為初始時的細胞數，T為培養時間。

2.8 數據處理 采用SPSS 23.0軟件對試驗數據進行分析，采用單因素方差分析和LSD多重比較及t檢驗法，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著性差異。

3 結果與分析

3.1 藻液中細菌對抗生素的敏感性 由表2可知，10種抗生素對鹽藻藻液中的細菌都有不同程度的抑菌殺菌作用。根據形成的抑菌圈直徑的大小，判斷鹽藻藻液中細菌對抗生素的敏感性從強到弱依次是：氨芐青霉素>氯霉素>慶大霉素>頭孢呋辛>硫酸鏈霉素>麥迪霉素>多黏霉素B>萬古霉素>強力霉素>克林霉素。其中，氨芐青霉素、氯霉素、慶大霉素、頭孢呋辛藥敏紙片上抑菌圈平均直徑在30～40mm，麥迪霉素、多黏霉素B、硫酸鏈霉素藥敏紙片上抑菌圈平均直徑在20～30mm，萬古霉素、強力霉素、克林霉素藥敏紙片上抑菌圈平均直徑在10～20mm，選取抑菌圈直徑>30mm的4種抗生素進一步檢驗鹽藻對其的敏感性。

3.2 鹽藻對不同抗生素及濃度的敏感性 根據圖1～圖4結果可知，不同抗生素種類和質量濃度可以引起鹽藻細胞生長密度的不同變化。當頭孢呋辛質量濃度50μg·mL-1時，鹽藻細胞的生長密度高于對照組;當青霉素質量濃度為50、100和200μg·mL-1時，頭孢呋辛的質量濃度為100μg·mL-1時，慶大霉素的質量濃度為50、100、200和400μg·mL-1時，鹽藻細胞生長的密度變化與對照組接近;氨芐青霉素的質量濃度為400μg·mL-1時，頭孢呋辛的質量濃度200、400μg·mL-1時，氯霉素的質量濃度在50、100、200和400μg·mL-1時鹽藻細胞生長密度低于對照組，且氯霉素各濃度組中細胞出現明顯的下沉老化現象。

采用單因素方差分析和LSD多重比較法，比較各抗生素各濃度組對鹽藻細胞生長密度的影響，結果如表3所示。由表3可知，當氨芐青霉素的質量濃度為50、100和200μg·mL-1時，頭孢呋辛的質量濃度50、100μg·mL-1時，慶大霉素的質量濃度為50、100、200和400μg·mL-1時，鹽藻細胞的生長密度與對照組差異不顯著（P>0.05）。但當頭孢呋辛的質量濃度為200、400μg·mL-1時，氯霉素的質量濃度為50、100、200和400μg·mL-1時，鹽藻藻株生長緩慢，細胞數呈現下降趨勢，鹽藻藻株生長則受到明顯抑制，且與對照組差異極顯著（P<0.01）。

3.3 鹽藻的無菌化處理和無菌檢測 比較各抗生素處理組中鹽藻的生長情況，如圖5所示。由圖5可知，按照無菌化方案Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ進行處理，鹽藻藻細胞比生長速率與對照組無明顯差異（P>0.05），按照無菌化方案Ⅴ進行處理，其比生長速率低于對照組，且與對照組差異顯著（P<0.05）;按照無菌化方案Ⅵ進行處理，其比生長速率則明顯低于對照組，且與對照組差異極顯著（P<0.01）。各無菌化處理方案獲得的鹽藻經3次傳代之后，接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基上，結果表明，經過無菌化方案Ⅵ、Ⅸ處理，鹽藻藻株已無細菌污染，而按照無菌化方案Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ處理仍有細菌存在。綜合各方案除菌效果和對鹽藻生長的影響，鹽藻無菌化處理方案優選無菌化處理方案Ⅸ。

3.4 自然帶菌藻和無菌鹽藻的生長曲線 比較帶菌藻和無菌藻的生長曲線，如圖6所示，第1～12d帶菌藻與無菌藻生長曲線無明顯差異，第1～3d為延滯期，第4d進入指數增長期，第11d進入穩定期;但進入第13d后，帶菌藻液細胞數量下降，出現下沉等老化現象，而無菌藻液細胞數量可以保持一段時間的穩定且藻液顏色均勻，未有藻細胞下沉等老化現象。

4 討論和結論

4.1 無菌化處理中抗生素的選擇 抗生素能夠有效抑制或殺滅細菌，是微藻無菌化處理的常用方法[7]。抗生素的使用需具備以下2個基本條件，一是具有高效抑菌殺菌活性，二是對微藻細胞毒性低。由于抗生素的抗菌譜存在差異，各微藻液中菌落結構不同，采用抗生素抑制或殺滅藻液中的細菌，在不同藻種以及劑量方面存在差異。鄭凌凌[8]等研究表明，使用卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素可以實現對雨生紅球藻FACHB-712藻株無菌化處理。周文俊[9]等研究表明，卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素可以完成對球等鞭金藻的無菌化處理。本研究選用了具有不同抗菌機理的氨芐青霉素、慶大霉素、萬古霉素等10種抗生素檢測對鹽藻藻液中細菌的抑制作用，同時為避免抗生素的使用抑制微藻細胞的生長，進行了鹽藻藻株對抗生素耐受性實驗，最終篩選質量濃度為200μg·mL-1的氨芐青霉素、50μg·mL-1的頭孢呋辛和400μg·mL-1慶大霉素作為鹽藻無菌化處理的抗生素。

4.2 抗生素使用方法的選擇 多種抗生素聯合使用具有協同作用，可有效去除藻液中的細菌，獲得無菌藻株。李靜華[10]等應用多種抗生素組合處理獲得波吉卵囊藻的無菌株;黃振華[11]等應用青霉素、慶大霉素等多種抗生素組合也獲得了球等邊金藻的無菌藻株;Cottrell[12]等認為作用機制的不同可能導致合用抗生素間產生拮抗，因此他們在微藻除菌中采用了逐種抗生素加入法也取得了成功。本研究設計了3種抗生素的單一使用，聯合同時及聯合逐次3種方式9種方案，結果顯示，氨芐青霉素、慶大霉素、頭孢呋辛3種聯合使用的除菌效果優于單一使用某一抗生素，且逐次使用抗生素可以減少對藻株生長量的影響同時獲取無菌藻株。但林偉[13]等研究發現，抗生素逐種加入不能獲得無菌的扁藻1040、中肋骨條藻及錐狀斯克利普藻，而同樣的聯合使用可以獲取無菌藻株，未發現抗生素對微藻細胞毒性的增強，研究結果的差異可能與抗生素使用的種類和濃度，以及體系中雜菌與藻細胞的相互關系相關。

4.3 抗生素無菌化處理對藻株的生長的影響 抗生素無菌化處理帶來的最大改變是微藻生長體系中細菌的數量和種類的改變，菌-藻之間有可能存在著共生、拮抗、互生等相互關系，一方種類和數量的改變會打破原有的平衡，本研究發現，無菌鹽藻和帶菌鹽藻在延滯期和指數生長期，細胞生產密度差異不顯著，但到達穩定期后自然帶菌鹽藻出現細胞密度下降，下沉老化的現象。形成這種現象的機理，有待進一步研究菌-藻之間的關系。

參考文獻

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（責編：張宏民）