乳酸菌作為基因工程菌的研究進展

黃佳明， 姜 寧， 張愛忠

（黑龍江八一農墾大學，黑龍江大慶 163319）

乳酸菌是一類能從碳水化合物中產生大量乳酸的一類細菌的總稱。常見的菌屬包括：乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸乳球菌和鏈球菌屬等。乳酸菌是全球公認安全級的微生物，不具有致病性，也是益生菌的一種，有諸多的益生功能。隨著基因工程技術的發展，通過引入新基因實現其在工程菌中的表達，達到改變其代謝功能或表達出一些功能性蛋白的目的，如抗菌肽等。應用基因工程技術改進現有菌株或開發新菌株是目前研究領域的熱點。隨著食品技術的發展以及對健康要求的改變，采用食品級的乳酸菌作為基因工程宿主菌引起研究者的廣泛關注。

1 作為工程菌的生物學功能

乳酸菌作為工程菌是因為其表現出的眾多的優勢。首先，與其他宿主菌相比，本身不產生內毒素，而且免去了分泌蛋白后期的分離純化步驟，可以直接實現活體菌株的飼喂。其次，由于分子生物學以及遺傳學的進步和發展，對乳酸菌有了更深層次的研究，對乳酸菌質粒基因的具體構造和功能的進一步了解，以及乳酸菌基因測序工作的完成（Altermann等，2005），推動了乳酸菌在基因工程技術上的應用。除此之外，乳酸菌具有黏附與定植功能，乳酸菌是有益菌，在人和動物腸道中廣泛存在，增加對乳酸菌的攝入，可以改善動物胃腸道的內環境，也可間接減少有害菌的數量，增加食物的消化率。另外，有研究表明乳酸菌可以增強腸道屏障功能，腸道黏液有著抗炎癥和抗感染的功能，其可作為腸道的屏障，Ren（2018）等研究了乳酸菌對參與腸道黏液合成的杯狀細胞相關基因的影響，證明了其可以增強相關基因的表達，以及對損傷的杯狀細胞有一定的修復作用，也證明了其可提高腸道黏膜的修復和再生功能。乳酸菌還具有殺菌作用，乳酸菌可分泌一些有機酸，有機酸本身就有一定的抑菌能力，還能解離出H＋，引起病原體表面膜電位的變化，進而使細菌死亡（Gálvez等，2014），也間接降低了環境的pH，抑制了有害菌生長。乳酸菌本身能分泌一些抗菌物質，對有害菌有一定的殺傷能力，如細菌素等。

2 基因工程宿主菌

2.1 乳酸乳球菌 乳酸乳球菌生長快，代謝簡單，基因組包含足夠的生物學信息，是安全級的微生物。自身不分泌蛋白酶，降低了外源蛋白被降解的風險。本身不分泌內毒素，也不產生任何的有毒物質，不會產生像大腸桿菌那樣的包涵體結構，基因組小自身分泌的蛋白質少，也有利于外源蛋白的分離純化。近年來，隨著電轉化技術的進一步發展，各種表達載體和克隆載體的建立，以及根據乳酸菌的自身特性發明的多種誘導系統，使得乳球菌作為基因工程宿主菌被廣泛地研究。從表1可以看出，乳酸乳球菌近年來作為基因工程宿主菌的研究主要集中在作為口服疫的應用上，基因ORF 6是豬繁殖和呼吸綜合征病毒基因，基因VP2是雞傳染病性法氏囊病毒的主要抗原蛋白，基因S1是通過PCR豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)的抗原蛋白基因得到的，基因DerP2是由塵螨引起的過敏性哮喘的過敏原基因，實現了各種病毒的免疫性抗原基因或抗原基因的衍生物在乳酸乳球菌中的表達。為由病毒引起的疾病動物提供了一種有效的治療手段。

表1 異源基因在乳球菌中的表達

2.2 乳酸桿菌 乳酸桿菌主要存在于人和動物的胃腸道中，是一種有益菌，在腸道中定植，有著諸多的益生功能。有研究發現，已經實現了各種乳酸桿菌中質粒的分離（Chassy等，1978)。雖然到目前為止，乳酸桿菌的研究沒有像乳球菌那么深入，但也已從乳酸桿菌中分離出了各種用于表達和翻譯的調控元件。隨著乳酸菌測序技術的完成，將其作為宿主菌的研究也越來越廣泛。由于乳酸桿菌相對于乳球菌作為宿主菌的研究起步較晚，所以直到現在乳酸桿菌還沒有食品級的表達載體，應用的主要是由紅霉素或氯霉素等抗生素基因標記的非食品級的表達載體。由表2中可以看出，乳酸桿菌中的干酪乳桿菌作為宿主菌得到了廣泛的應用，主要表達的是引起動物產生疾病的病毒抗原蛋白基因，將含有抗原基因的重組菌株通過口服或注射的方式導入動物體內來間接引起動物產生免疫性反應。除此之外，由于乳酸桿菌可以實現在動物腸道中的定植和黏附，可以在乳酸桿菌中表達一些功能性蛋白，比如將抗菌肽以及一些酶制劑的基因導入乳酸桿菌，將重組菌株直接飼喂動物，這樣不僅減少了表達產物后期分離純化的麻煩，還可以實現功能性藥物在動物胃腸道源源不斷的產生，持續發揮作用的目的。

表2 異源基因在乳酸桿菌中的表達

2.3 雙歧桿菌 雙歧桿菌是從人的糞便中分離出來的一種革蘭氏陽性桿菌，廣泛存在與人和動物腸道中以及口腔中，其有諸多的益生功能，可以維持腸道菌群平衡以及機體的免疫調節，對動物的腹瀉有著很好的治療作用。從表3可以看出，雖然雙歧桿菌實現了多種外源基因的表達，但對其的研究還不夠深入，到目前為止，雙歧桿菌還沒有一套成型的表達系統。主要原因有兩個，一個是對其的研究較晚，2002年才實現基因的測序工作（Schell等，2002），另一重要的原因是雙歧桿菌中存在質粒的菌株較少，有研究表明，在32株雙歧桿菌中僅有五株發現了有質粒的存在，這些使雙歧桿菌作為表達系統發展緩慢。但雙歧桿菌有著清楚的遺傳背景，隨著基因技術的發展，可以實現對雙歧桿菌的內部改造，達到讓其作為優秀工程菌的目的。其本身作為安全級微生物，以及具有可以在動物腸道中定植的特性，使雙歧桿菌有著很好的開發和應用前景。

3 基因工程乳酸菌的應用

3.1 在疫苗領域中的應用 乳酸菌可以在黏膜系統黏附以及人和動物腸道中定植，使其在疫苗的開發及應用上引起了人們的關注。目前基因工程乳酸菌在疫苗中的應用主要是作為疫苗的傳遞載體，已經證明乳酸菌可以有效的在黏膜系統中傳遞，其克服了將功能性蛋白質傳遞到黏膜組織的問題。通過鼻內途徑，證明了活的和殺死的乳酸菌疫苗菌株都能引起黏膜和全身免疫反應。Wells（2011）研究表明，乳酸菌作為黏膜傳遞系統的可行性，這種新的傳遞系統已清楚地顯示出乳酸菌疫苗的免疫原性和保護性免疫的潛力。此外，乳酸乳球菌口服給藥可誘導抗原特異性口服耐受（OT）分泌重組抗原。與純化的抗原相比，乳酸菌作為傳遞疫苗在誘導OT方面更有效，這就避免了純化大量抗原的需要。這種方法在過敏反應和抗原誘導的自身免疫性疾病中具有治療和干預作用。花生過敏（PNA）已成為世界范圍內不可忽視的健康問題。迄今為止，誘導黏膜耐受的過敏原特異性免疫治療已被廣泛認為是PNA的主要治療策略。乳酸菌的安全特性和固有的益生菌特性使它們成為黏膜疫苗的有吸引力的遞送載體。Ren等（2014）利用轉基因乳酸乳球菌，通過不同的蛋白靶向系統產生花生過敏原Ara h 2，并觀察其對小鼠過敏性免疫反應的免疫調節作用。研究表明，與表達Ara h 2（LL1)胞質形式的菌株相比，表達Ara h 2（LL2和LL3)的分泌和錨定形式的菌株在將Th2極化重新導向非過敏性Th1免疫應答方面更有效。通過口服重組乳酸鏈球菌，還可以在局部水平觀察到SIgA和調節性T細胞的誘導。通過鼻內注射（IN）途徑注射流感疫苗與常規肌肉注射相比更有吸引力。這表明，給藥的方式不僅僅只是一種形式，還具有一定的優勢，除了全身抗體外，還有誘導局部保護性抗體的潛力，即S-IgA。Berlec等（2012)探索了在小鼠鼻內免疫后誘導保護性抗體應答中使用安全的佐劑系統。用乳酸乳球菌食品級的細菌抗原顆粒（BLPs)感染小鼠，研究發現，用BLPs疫苗免疫的小鼠，與沒用疫苗免疫的小鼠相比，在被同源或異源的病毒攻擊時被感染的機率顯著降低。證明了用BLPs佐劑接種的流感疫苗可有效增強全身和局部抗體應答，對同源和異源病毒的感染有著顯著的保護作用。

表3 異源基因在雙歧桿菌中的表達

3.2 在飼養領域的應用 基因工程乳酸菌在養殖領域也有著廣闊的應用前景，首先乳酸菌本身添加到飼料中就可以改變飼料的品質，提高飼料的消化率。其次如果將纖維素酶基因和淀粉酶基因通過基因工程手段實現在乳酸菌中的表達，這樣的乳酸菌用于青貯飼料，在乳酸菌作用的基礎上，還能分泌一些蛋白酶和淀粉酶，可以提高纖維素的降解率，有助于動物的消化。高云航等（2015)設計合成的纖維素酶基因導入乳酸菌中，經誘導表達，得到了對纖維素具有分解活性的表達蛋白，酶活力為0.57 U/mL。王艷（2017)將多黏類芽孢桿菌纖維素基因導入乳酸菌中，成功獲得了具有分泌能力的重組乳酸菌。證明了重組乳酸菌在飼料領域有著很好的發展前景，其在動物中也有很好的應用，剛出生的仔豬其消化道與腸道發育不完全，腸道菌群沒有定型，消化不良和腸道菌群功能紊亂引起的疾病使仔豬有著較高的死亡率。將基因工程的乳酸菌飼喂仔豬可以在一定程度上改善這個問題。尹清強等（2006)將淀粉酶基因導入到豬的消化道乳酸菌中，將重組菌株飼喂仔豬，不僅彌補了仔豬腸道菌群的內環境問題，同時表達的淀粉酶在腸道中實現分泌，也間接緩解了淀粉酶在仔豬腸道中分泌不足問題。在動物中的另一個應用是構建疫苗載體，如將一些引起動物產生疾病的病毒的抗原基因在乳酸菌中表達，重組菌種作為活體疫苗飼喂動物，這樣可以取得很好的防治效果。

4 小結與展望

隨著基因工程技術的發展，乳酸菌表達系統已經實現了在多個領域的應用。通過基因工程改造的乳酸菌有著更為廣泛的應用前景。目前已經在微生態制劑、藥品、活菌疫苗、飼料添加劑等多個領域應用。但乳酸菌作為工程菌還存在一些需要解決的難題。首先就是大多數表達系統中的載體和標記基因不是“食品級”的,“食品級”的應用較少，存在安全隱患。其次乳酸菌在動物腸道中定植存在耐受問題。最后就是乳酸菌表達外源基因的表達量不是很理想，對功能性蛋白的表達研究也較少。這不僅是乳酸菌作為基因工程菌所存在的問題，也是基因工程菌這個系統所面臨的問題。乳酸菌是安全級微生物，必是未來發展的熱點。