免疫組化法在結核病理診斷中的應用

雷戰平

【摘要】 目的：分析免疫組化法在結核病理診斷中的應用。方法：選擇湖南省胸科醫院2015年1月-2017年9月確診為結核病的79例患者，均對其行免疫組化法檢測，對所有患者臨床資料進行回顧性分析。結果：抗酸桿菌（AFB）檢出26例，檢出率為32.91%，BCG抗原檢出54例，檢出率68.35%，AFB檢出率明顯低于BCG抗原檢出率，差異有統計學意義（字2=9.868 9，P<0.05）。AFB、BCG抗原在結核結節、滲出性結核中的檢出率比較，差異無統計學意義（P>0.05）;BCG抗原檢測率在干酪樣壞死灶、不完全壞死灶、纖維化鈣化灶、壞死灶旁纖維組織中高于AFB，差異有統計學意義（P<0.05）。蛛網膜下腔和肝中，AFB、BCG抗原檢出率比較差異無統計學意義（P>0.05）;BCG抗原檢出率在肺、肺門淋巴結、頸淋巴結中檢出率高于AFB，差異均有統計學意義（P<0.05）。13例原發性肺結核中，AFB檢出7例，檢出率為53.85%，BCG抗原檢出檢出8例，檢出率為61.54%，在原發型肺結核中檢出率比較差異無統計學意義（字2=3.075 3，P>0.05）;39例繼發性肺結核中，AFB檢出13例，檢出率為33.33%，BCG抗原檢出24例，檢出率為61.54%，BCG抗原檢出率較高，差異有統計學意義（字2=9.896 3，P<0.05）。結論：免疫組化法應用在結核病診斷為較好的診斷方法，值得借鑒。

【關鍵詞】 免疫組化法; 結核病; 診斷

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.07.033 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2019）07-00-03

肺結核是發生在肺組織、氣管、支氣管和胸膜的結核病變，結核分枝桿菌是人類結核病的病原菌，常作為結核病診斷的金標準。診斷結核疾病的方法有多種，如X線、抗酸染色、PPD試驗及病理切片等。然而X線出現誤診或漏診的概率較大，且該檢查方法費用較高，操作較為復雜[1]。PPD試驗雖為檢測該疾病的常用方法，但其假陽性較高;病理切片方法診斷率較高，但由于檢測時間相對較長，因而要尋求新的檢測方法，如免疫組化法。本研究選擇筆者所在醫院收治的79例患者作為研究對象，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇湖南省胸科醫院2015年1月-2017年9月確診為結核病的79例患者，所有病例符合國家衛生行業標準-肺結核診斷標準，咳嗽、咳痰≥2周，或痰中帶血或咯血為肺結核可疑癥狀。其中男37例，女42例，患者年齡3～75歲，平均（49.76±7.85）歲，病程2～7個月，平均（3.86±0.96）個月;結核感染部位：肺結核27例，淋巴結核30例，其他部位22例;結核病變：結核結節31例、干酪樣壞死灶39例、滲出性結核32例、不完全壞死灶33例、纖維化鈣化灶33例、壞死灶旁纖維組織13例;器官：肺27例、肺門淋巴結21例、頸淋巴結9例、蛛網膜下腔13例、肝9例;原發性肺結核13例、繼發性肺結核39例，肺外結核27例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法 （1）石蠟標本制作：樣本（肺及淋巴結等）取出后將其立即放入福爾馬林中，濃度為10%，24 h后行脫水（采用乙醇）處理，而后進行透明處理，采用的是二甲苯（PX），2 h后將雜質去除，石蠟包埋。（2）制片：將石蠟切開呈片狀，厚度以4 μm為宜，將蒸餾水（1 ml）滴在載玻片上并烘干，使用恒溫水浴鍋。（3）磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，5 min/次，在標本上滴過氧化氫的甲醇溶液，時間以12 min為宜;沖洗后封閉，30 min后將多余液體傾出。（4）將卡介苗（BCG）多克隆抗體一抗適量加入并過夜，溫度以4 ℃為宜，次日再次PBS沖洗5 min，沖洗3次。（5）將適量二抗加入，15 min后再次PBS沖洗，沖洗次數同上。（6）二氨基聯苯胺（DAB）顯色：將DAB顯色劑滴在組織標本上，其染色程度需借助顯微鏡，而后行PBS沖洗，10 min后停止。（7）復染，采用的蘇木精，4 min后用酒精分化，而后進行沖洗（19 min）。（8）常規梯度酒精脫水，二甲苯處理后，中性樹膠封片。

1.2.2 抗酸染色 另外對所有患者標本（肺及淋巴結等）進行抗酸染色，檢測抗酸桿菌（AFB）。步驟：（1）火焰固定;（2）滴加石炭酸復紅染液，在火焰高處徐徐加溫至冒蒸氣，并維持5 min（注意切勿讓染液沸騰或煮干），當染液蒸發減少時，需再加染液補充。待標本片冷卻后水洗;（3）用3%鹽酸酒精脫色，至無肉眼可見紅色為止后（反復2～3次，一般需要1～2 min）水洗;（4）用堿性美藍復染1 min，水洗。

1.3 觀察指標

比較結核檢出率;比較抗酸桿菌（AFB）、卡介苗（BCG）抗原在各結核病變中的檢出率;比較AFB、BCG抗原在不同器官中檢出率;比較原發、繼發性肺結核的AFB、BCG抗原檢出率。

1.4 統計學處理

本研究數據采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析和處理，計量資料以（x±s）表示，計數資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結核檢出率比較

79例患者中，檢出AFB 26例，檢出率為32.91%，檢出BCG抗原54例，檢出率為68.35%，AFB檢出率明顯低于BCG抗原檢出率，差異有統計學意義（字2=9.868 9，P<0.05）。

2.2 AFB、BCG抗原在各結核病變中的檢出率比較

AFB、BCG抗原在結核結節、滲出性結核中的檢出率比較，差異無統計學意義（P>0.05）;BCG抗原檢測率在干酪樣壞死灶、不完全壞死灶、纖維化鈣化灶、壞死灶旁纖維組織中高于AFB，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 AFB、BCG抗原在不同器官中檢出率比較

蛛網膜下腔和肝中，AFB、BCG抗原檢出率比較，差異無統計學意義（P>0.05）;BCG抗原檢出率在肺、肺門淋巴結、頸淋巴結中檢出率高于AFB，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3 原發、繼發性肺結核的AFB、BCG抗原檢出率

13例原發性肺結核中，AFB檢出7例，檢出率為53.85%，BCG抗原檢出檢出8例，檢出率為61.54%，在原發型肺結中核的檢出率比較，差異無統計學意義（字2=3.075 3，P>0.05）;39例繼發性肺結核中，AFB檢出13例，檢出率為33.33%，BCG抗原檢出24例，檢出率為61.54%，BCG抗原檢出率較高，差異有統計學意義（字2=9.896 3，P<0.05）。

3 討論

結核病是一種傳染性疾病，現如今我國患該疾病的概率較高，每年約130萬[2]，WHO及我國較關注該疾病的防治。該疾病有較為廣泛的傳播途徑，如食物、空氣等，有較大的危害性，患病后會使其心理、生理受到不良影響。社會在發展，抗結核藥物也相繼上市，降低了全球結核疾病的感染率，這些藥物包括利福平、異煙肼等。然隨著人類免疫缺陷病毒的出現，加上結核分枝桿菌的變異，使部分患者對抗結核藥物耐藥，使結核疾病再次被WHO的重視[3-4]。結核疾病由感染結核分枝桿菌所致，該病菌的形狀是彎曲的，呈細長型，大量脂質存儲在細胞壁內，脂質量多時可阻止一般的消毒劑進入胞內，具體為對外界環境（如自然環境、酸、堿等）的抵抗力較強，但濕熱、紫外線及酒精可透過脂質，進入胞內。結核疾病在早期治療可減少其對機體內其他臟器的破壞減少或不對其造成損害[5-6]。

現如今分子生物學發展迅速，可使用免疫組化技術對其檢測。該檢測方法可將組織固定在福爾馬林溶液中，致使組織中的抗原蛋白發生化學反應，封閉部分抗原決定簇，將抗原免疫反應活性降低，使BCG檢出率減低。要克服此種現象，在染色時解除組織固定時所形成的交聯現象，暴露或恢復抗原。由本次研究結果可知，免疫組化技術檢出率較高，為68.35%，喻永澤等[7-8]采用免疫組化法診斷結核疾病，其準確率為71.38%，本次研究結果與之相符。由此提示，對于結核疾病患者使用免疫組化技術有較高的檢出率。有研究顯示，AFB較少表達慢性結核疾病，如纖維化鈣化灶、廣泛干酪樣壞死區等，然對其行BCG陽性率較高[9-10]，結合本次研究結果，慢性結核疾病使用AFB檢出率較低，而BCG檢測率較高，與之相符，由此提示BCG抗原檢測適用于AFB陰性、結核組織病變不典型患者。但亦有報道顯示，對于滲出性結核病使用BCG檢測，其檢測率明顯低于抗酸染色檢測率。由此證明要更為準確的檢測結核疾病，可聯合使用此兩種檢測方法[11]。BCG抗原檢測有較高的陽性率，除外陳舊性結核疾病，可能是由于隨著疾病的進展，結核菌抗原突變，其性質、成分發生改變。有學者給動物注射BCG，開始出現結核時抗原成分未消失，包括AFB、多糖1及菌蛋白B1等，隨著病情發展，出現干酪樣壞死灶時上述抗原菌消失，但使用其他免疫組化染色（抗臘質D抗體及抗整個結核菌）時，顯示陽性[12]。本次研究中使用的不是單克隆抗BCG，可結合多種BCG抗原，進而較好地將急性、慢性疾病顯示。

綜上所述，免疫組化法能有效地提高結核病的診斷率，值得借鑒。

參考文獻

[1]楊文軍.肺結核不典型X線CT影像學表現及誤診漏診原因分析[J].中國繼續醫學教育，2014，6（2）：11-12.

[2]劉慶榮，賀曉新，曹凱，等.2005～2013年北京地區肺結核病時間流行特征及預測[J].中國醫刊，2015，65（5）：105-107 .

[3]張洪蘭，張昶，陳昊.全自動與手工免疫組化法在檢測5種惡性腫瘤Her-2表達中的應用[J].診斷病理學雜志，2016，23（10）：796-797.

[4]楊榮，武振華，王玉玲，等.非小細胞肺癌中HER-2和EGFR的表達及其與臨床表現的關系[J].臨床與實驗病理學雜志，2014，30（7）：801-803.

[5]龍曉雨，步宏，魏兵，等.雙色銀染原位雜交與熒光原位雜交檢測胃癌患者HER2基因狀態[J].中華病理學雜志，2011，40（5）：300-303.

[6]王春花，龐學文，傅衍勇.非結核分枝桿菌相關研究新進展[J].結核病與肺部健康雜志，2015，4（1）：61-65.

[7]喻永澤.免疫組化技術、原位雜交技術用于結核病診斷中的價值評價[J].中國現代藥物應用，2017，11（3）：55-56.

[8]于兵兵，劉艷峰，胡延濤，等.免疫組化技術、原位雜交技術檢測尖銳濕疣結果對比分析[J].心理醫生，2015，21（22）：135-136.

[9]丁玉龍.白細胞介素-17A及骨橋蛋白在肺結核治療過程中免疫調節機制研究[D].杭州：浙江大學，2017：1-107.

[10]丁佩佩，何綱，陳曉華，等.HIV/HCV共感染者外周血輔助性T細胞17和IL-17A水平檢測[J].實用肝臟病雜志，2015，18（1）：30-33.

[11]覃松梅，羅谷容.結核抗體檢測對照BCG-PPD皮試的診斷價值初探[J].廣西醫學，2001，23（2）：329-330.

[12]梁媛，馮洋洋，李琳琳，等.MicroRNA-29a靶向抑制PTEN基因誘導非小細胞肺癌細胞上皮間質轉化的機制研究[J].現代腫瘤醫學，2018，26（5）：653-659.