NK細胞在晚期結腸癌綜合治療中的應用研究

王聰潔 楊麗麗 李朝陽

[摘要] 目的 探討自體NK細胞聯合化療、靶向治療對晚期結腸癌患者的綜合治療療效。 方法 收集2015年6月～2017年10月本院Ⅳ期結腸癌患者37例，治療方案經患者知情同意，共分為兩組，單克隆靶向藥聯合化療藥物和體外培養NK細胞（A組）17例，化療聯合單克隆靶向藥物治療20例（B組），均經病理證實為結腸腺癌。統計患者治療療效，分析治療前后PS評分、粒/淋（Neutrophil to Lymphocyte Ratio，NLR）比值、NK細胞水平改變，觀察不良反應發生率，兩組患者經過3～12個月的隨訪，參照實體瘤評價標準1.1版評估患者疾病控制率（Disease control rates，DCR）、中位疾病進展時間（Time To Progress，TTP）。 結果 A組NK細胞數量及活性較B組明顯上升，粒/淋比值水平顯著下降（P=0.002）;A組控制率（DCR）較B組改善明顯（P=0.018）;功能狀態評分（PS評分）兩組均有改善，A組較B組改善明顯（P=0.024），疾病進展時間（TTP）顯著延長（P=0.003）;輸注過程中不良反應發熱不適組間無明顯差異性，A組3、4級骨髓抑制發生率較B組有顯著改善（P=0.04）。 結論 化療、單克隆靶向藥物聯合NK細胞治療能夠提高藥物抗腫瘤殺傷性，改善結腸癌患者基礎免疫狀態，降低化療及靶向藥物毒副反應，一定程度上提高帶瘤生存質量，延長生存期。

[關鍵詞] NK細胞;結腸癌;綜合治療;單克隆靶向藥物

[中圖分類號] R735.35 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] B ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）14-0072-05

[Abstract] Objective To investigate the comprehensive treatment effect of autologous NK cells combined with chemotherapy and targeted therapy on patients with advanced colon cancer. Methods A total of 37 patients with stage Ⅳ colon cancer treated in our hospital from June 2015 to October 2017 were enrolled. The treatment plan was informed and consented by the patients. The patients were divided into two groups， including 17 cases of monoclonal antibody-targeted drugs combined with chemotherapy drugs and in vitro cultured NK cells（group A）， and 20 cases of chemotherapy combined with monoclonal targeted drug therapy（group B）， with all confirmed with colon adenocarcinoma by pathology. The therapeutic effects of the patients were analyzed. The PS score， the Neutrophil to Lymphocyte Ratio（NLR） and the level of NK cells before and after treatment were analyzed. The incidence of adverse reactions was observed. The three groups were followed up for 3-12 months. The patient's disease control rate（DDR） and time to progress（TTP） were evaluated ? referring to solid tumor evaluation criteria version 1.1. Results The number and activity of NK cells in group A were significantly higher than those in group B， and the ratio of granules in group A was significantly decreased（P=0.002）. In the aspect of therapeutic effect， the disease control rate（DCR） of group A was significantly improved compared with that of group B（P=0.018）; functional status scores（PS scores） improved in both groups， and the scores of group A improved significantly compared with that of group B（P=0.024）， and disease progression time（TTP） was significantly prolonged（P=0.003）. There was no significant difference in adverse reactions during infusion between two groups. The incidence of grade 3， 4 myelosuppression was significantly improved in group A compared with that of group B（P=0.04）. Conclusion Chemotherapy， monoclonal targeted drugs combined with NK cell therapy can improve the anti-tumor killing effect of drugs， improve the basic immune status of colon cancer patients， reduce the side effects of chemotherapy and targeted drugs， and improve the quality of life of tumors and prolong survival.

[Key words] NK cells; Colon cancer; Comprehensive treatment; Monoclonal targeted drugs

近年來，中國結腸癌發病率呈上升趨勢，嚴重威脅人類身體健康[1]。目前結腸癌的治療從過去單純的手術、放療、化療，逐漸發展到單克隆靶向藥物、免疫檢查點抑制劑、過繼細胞免疫治療，以及幾種模式聯合治療在內的多種治療途徑。特別是自2013年癌癥免疫療法被《Science》雜志評為最重要的醫學科學突破，NK細胞過繼細胞免疫治療處在快速發展階段，被廣泛用于腫瘤的治療研究和開發利用。

NK細胞作為免疫防御系統的第一道防線，通過表達CD56、NKP46等能在非主要組織相容性復合體（MHC）中裂解腫瘤細胞和病毒感染細胞，且無需預先致敏[2]，進而發揮免疫防御功能，解決實體腫瘤細胞缺少理想靶點這一問題。多項研究發現機體內NK細胞數量與患者生存期密切相關，而大部分腫瘤患者存在腫瘤的消耗和營養的下降，體內NK細胞數量明顯減少[3，4]。研究顯示體外活化擴增的NK細胞具有更好的抗腫瘤治療效果，提高腫瘤的殺傷率，且不會引起移植物抗宿主反應（GVHD）[5]。靶向藥物發展日新月異，因其特異性高、副作用小，有著“個體化”治療的美譽，受到臨床醫生的親睞和腫瘤患者的歡迎。NK細胞免疫治療是單克隆抗體通過ADCC活化介導特異性抗腫瘤的最主要的效應細胞，主要通過NK細胞表面表達Fcγ受體（CD16），能夠識別腫瘤細胞表面的IgG1 和IgG3單克隆抗體 Fc段，介導NK 細胞識別被抗體包被的靶細胞，啟動抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，進而殺傷靶細胞。目前NK細胞在國內外的臨床研究應用分布較為廣泛，然大多數是對于NK免疫活性或機制的基礎研究，真正進行臨床運用的極少，本研究具有較高的創新性和前瞻性。

1 資料與方法

1.1臨床資料

回顧性分析2015年6月～2017年10月本院Ⅳ期結腸癌患者治療數據，共收集入組患者37例，分為兩組，NK細胞聯合單克隆靶向藥物、化療（A組）17例;化療聯合靶向藥物組（B組）20例。全部患者均按報批的衛計委三類新技術實施方案進行（患者均經充分知情同意），診斷分期根據美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）結腸癌指南（2017年版）[6]，均經病理證實為結腸腺癌。A組平均年齡（55.00±6.26）歲，男11例，女6例，B組平均年齡（59.34±7.37）歲，男12例，女8例，兩組在年齡、性別等一般資料上無統計學差異。統計患者治療前后PS評分、粒/淋（Neutrophil to Lymphocyte Ratio，NLR）比值、NK細胞水平改變，觀察治療中出現的發熱不適反應及治療后的骨髓抑制情況，兩組患者經過3～12個月的隨訪，參照實體瘤評價標準1.1版[7]評估患者有效率（Response Rate，RR）、疾病控制率（Disease control rates，DCR）、中位疾病進展時間（Time To Progress TTP）。

1.2 納入及排除標準

納入標準[8，9]：（1）免疫組化證實腫瘤EGFR陽性或弱陽性的腫瘤患者，Kras基因均為野生型[10];（2）接受常規一線化療后進展或復發;（3）各組年齡、性別、腫瘤分期相當進行入選;（4）經倫理委員會通過及患者充分知情同意，簽署知情同意書。排除標準[8，9]：（1）一般情況差、年老體弱、PS大于3分，無法耐受者;（2）骨髓功能差、嚴重貧血和白細胞和血小板降低;（3）嚴重肝腎功能異常;心血管、肺功能障礙者;（4）做過大面積放療、高齡、嚴重感染、腎上腺功能不全等;（5）缺乏適當的支持設施，不能充分合作的患者;（6）嚴重過敏體質者;自身免疫病患者;（7）正在使用免疫抑制劑或器官移植;（8）頑固的或持續癲癇患者;孕婦與哺乳期婦女;（9）多臟器功能衰竭期。

1.3 治療方案

A組EGFR單克隆抗體靶向藥物“西妥昔單抗注射液”起始劑量400 mg/m2，隨后1周250 mg/m2生理鹽水稀釋（按使用說明書）后靜滴，續以靜滴制備好的NK細胞，治療前使用異丙嗪等輔助藥;化療方案為FOLFOX6方案：奧沙利鉑+亞葉酸鈣+5-氟尿嘧啶：5-氟尿嘧啶化療周期第1天靜滴（400 mg/m2），之后化療泵持續靜脈滴入（46 h）;奧沙利鉑：化療周期第1天100 mg/m2，3 h內完成，亞葉酸鈣：化療周期第1天靜脈滴注（400 mg/m2）。B組在EGFR單克隆抗體靶向藥物“西妥昔單抗注射液”給藥后，按FOLFOX6方案進行化療。注：（1）NK細胞培養嚴格遵照“NK細胞制備操作規程”和遵守“質量控制標準”;（2）根據患者體表面積，計算靶向藥及化療藥物總使用劑量;（3）A組NK細胞D1-3及靶向藥物D1-3（西妥昔單抗注射液1個療程劑量分3次加入NK細胞懸液中）第1天開始輸注，靶向藥物同NK細胞分3 d靜滴輸入;（4）治療前測量患者生命體征，使用異丙嗪減輕和預防過敏反應;（5）治療過程中使用心電監護和血氧飽和度監測。

注：奧沙利鉑：化學名（1R，2R）-（1，2環已烷-二胺-N，N）[（乙二酸（2-）-O，O]絡鉑，生產廠家江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，國藥準字50 mg H20000337， 100 mg H20040817，規格50 mg，100mg。5-氟尿嘧啶：化學名5-氟-2，4（1H，3H）-嘧啶二酮，生產廠家天津金耀藥業有限公司，國藥準字H12020959，規格0.25 g/10 mL。亞葉酸鈣：化學名N-[4-[（2-氨基-5-甲?；?4-氧代-1，6，7，8-四氫-6-蝶啶基）甲基]氨基]苯甲酰基-L-谷氨酸鈣鹽，生產廠家江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，國藥準字0.1 g H32022391，規格0.1 g。西妥昔單抗注射液：生產廠家德國默克公司，注冊證號S2005 0095，規格100 mg/50 mL。

1.4 NK細胞的制備

1.4.1 實驗材料 ?淋巴細胞分離液：比重1.077。ksNK試劑盒：試劑A液、工程細胞A、工程細胞B。 ksNK專用培養基（PNS-0300）。T25培養瓶，T75培養瓶，超凈工作臺，離心機，倒置顯微鏡，血細胞計數儀，CO2培養箱，抗CD16-PE抗體，抗CD56-PE抗體，抗CD3-FITC抗體，生理鹽水。

1.4.2 NK細胞的分離、擴增和活化 ?準備工作：打開超凈工作臺的紫外燈，照射30 min。細胞分離及培養：肝素抗凝的60 mL外周血作為生產標本準備。通過淋巴細胞分離液分離出單個核細胞（PBMC），預計獲得（4～9）×107個細胞即可。對單個核細胞進行洗滌、重懸，計數后每（3.5～4.5）×107個細胞用20 mL NK專用培養基（含IL-2因子100 U/mL）重懸并加入1支工程細胞A，添加1 mL自體血清，轉移至1個75 cm2培養瓶，當每份細胞體積達到80～120 mL時，加入1支工程細胞B并等體積補液，于37°C、5% CO2培養箱中培養（每人份宜接1～2個75 cm2培養瓶）。根據細胞懸液狀態添加培養液，第7～9天再次刺激，培養液體積大于200 mL或細胞量大于2×108時，轉移至培養袋培養，第8～14天補液：觀察或計數，根據顏色變化或細胞濃度添加培養液，使得細胞濃度在（2～3）×106 Cell/mL。第15～17天收集：細胞增殖達到對數期，收集細胞進行回輸。細胞收集，每次收集細胞，按照細胞回輸量，可將培養袋中的細胞轉入50 mL離心管中。1200 rpm，離心10 min，棄上清，加150 mL生理鹽水，添加2%白蛋白，并用1支50 mL注射器轉入250 mL轉移袋中。用熱合機封口，封3道，貼標簽，備用。

1.4.3 NK細胞鑒定 ?待細胞培養至一定數量時[（2～3）×106/L]，用PBS或0.9%氯化鈉重懸，調整細胞濃度至1×106/mL，用FITC標記的抗CD3抗體，PE標記的抗CD56、CD16抗體在4℃條件下孵育30 min，生理鹽水洗滌兩次（5 min/次），重懸至1 mL，立即用流式細胞儀檢測，檢測結果細胞CD16+、CD56+水平。

1.5 PS評分標準

評分標準[11]：0分：與起病前無任何差異，活動能力完全正常;1分：能從事輕體力活動，可下地自由走動;2分：能下地自由走動，做到生活自理，但已喪失工作能力，日間下地活動時間不小于50%;3分：生活僅能部分自理，日間臥床或坐輪椅時間超過50%;4分：臥床不起，生活不能自理;5分：死亡。

1.6 療效評價標準

入組患者治療前28 d完善所有目標內評估，明確目標內病灶，排除隱性病灶，檢測手段包括PET-CT、增強CT、X線、B超等。病灶直徑測量采用增強CT評估。評估標準參照實體瘤RICIST 1.1版[7]：（1）完全緩解（CR）：對于本研究評價要求完成所有目標病灶（包括術后病灶原位復發灶、肝轉移病灶、肺轉移病灶等）評價，所有目標病灶縮小至正常大?。ǘ梯S<1 cm）;除結節性疾病外，所有目標病灶完全消失。（2）部分緩解（PR）：所有可測量目標病灶的直徑總和低于基線≥30%。目標結節總和使用短徑，其他目標病灶的總和使用最長直徑。（3）疾病進展（PD）：所有測量的靶病灶直徑之和的最小值為參照，直徑和相對增加至少20%（如果基線測量值最小就以基線值為參照）;且所有直徑和的絕對值增加至少5 mm;出現一個或多個新發病灶即視為進展。（4）疾病穩定（SD）：靶病灶減少或增大程度介于PR和PD之間，以直徑之和的最小值作為參考。（5）排除不確定性因素。

1.7統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件分析，計數資料采用均數±標準差（x±s）或中位數（M）表示，用獨立樣本t檢驗和配對t檢驗;計數資料采用[n（%）]表示，用Fisher檢驗;單因素生存分析采用Kaplan-Meier分析，用Log-rank顯著性檢驗;P<0.05為差異具有統計學意義，P<0.01表示差異有高度統計學意義。

2 結果

2.1 兩組治療前后粒/淋比值比較

A組治療前后粒/淋比值明顯改善，有高度統計學意義（P<0.01）;A組較B組粒/淋比值水平顯著下降，有高度統計學意義（t=3.7，P=0.002）（表1）。

2.2兩組治療前后患者體內NK細胞水平比較

A組NK細胞數量得到明顯提升，有高度統計學意義（P<0.01），B組NK細胞數量無明顯變化;A組較B組NK細胞變化有高度統計學意義（t=10.2，P<0.01）（表2）。

2.3兩組治療前后PS評分比較

A組、B組患者功能狀態評分均有不同程度改善，A組較B組改善程度明顯，有統計學意義（t=2.5，P=0.024）（表3）。

2.4 兩組療效評價

使用RICIST 1.1版實體瘤療效評價標準，A組治療療效較B組控制率（DCR）改善明顯;兩組經過3～12個月的隨訪時間，A組中位TTP 7.3個月，B組中位TTP 4.8個月，兩組組間疾病進展時間有高度統計學意義（χ2=8.884，P=0.003<0.01），A組療效明顯優于B組（表4，封三圖3、4）。

2.5 不良反應

A組治療過程中發熱不適較B組無明顯差異性，骨髓抑制情況（白細胞、中性粒細胞、紅細胞、血小板）3、4級骨髓抑制率A組較B組有顯著改善，有統計學意義（P=0.04）（表5）。

3討論

結腸癌早期即可發生轉移，80%～90%面臨不可切除的肝轉移和嚴峻的預后，5年生存率低于12%。NK細胞數目及CD16+、CD56+的高低對腫瘤的發生、發展過程有一定的警示作用，長期低水平NK細胞人群的腫瘤發生率明顯升高，NK細胞殺傷活性會明顯下降;而NK細胞水平的升高提示良好的預后[12]。

有研究[13]報道10例急性粒細胞白血病兒童（0.2～21歲）輸注外源性NK細胞，同時聯合環磷酰胺和氟達拉濱的治療，輸注后進行6次IL-2（100萬U/m2）的催化，體內NK細胞數量明顯上升，約14 d達到高峰。患者顯示了較好的安全性和適應性，癥狀較同類化療改善明顯。Miller 等[8]進行30例患者的臨床試驗，包括10例轉移性黑色素瘤，1例霍奇金淋巴瘤和19例急性粒細胞白血病，在進行環磷酰胺和氟達拉濱化療后，分組分別輸1×105，1×106，1×107和2×107 cell/kg，維持2周時間的IL-2 1.75×106 IU/m2促進NK細胞的增殖和活性，除個別患者近期出現了惡心、嘔吐、失眠等癥狀，總體不良反應較輕，患者抗腫瘤免疫力較前明顯提高。國內楊孟寅等[14]報道1例腦膠質瘤的患者接受共5次人血回輸NK細胞（1.5～1.9×109個）的臨床治療，隨訪26個月，患者影像學表現為CR，顯示了較好的臨床效果;顧霞[9]團隊進行了20例Ⅲ～Ⅳ期晚期非小細胞肺癌NK細胞輸注的臨床研究，患者功能狀態評分及基礎免疫功能得到顯著改善。目前國內外實驗室研究報道較多，NK細胞臨床應用研究處在起步階段，對于結腸癌等實體腫瘤臨床應用較少，本研究具有較高的前瞻性。

本研究共納入37例Ⅳ期結腸癌患者，分析NK細胞聯合化療、靶向治療17例（A組）、化療聯合靶向治療20例（B組）兩種模式下治療療效，觀察發現A組經NK細胞輸注后，NLR明顯降低，較B組明顯改善（P<0.01）。研究表明化療前后NLR水平高低可以作為消化道腫瘤潛在預后指標，高NLR往往預后不佳，與腫瘤進展密切相關[15]。治療前后比值的變化在一定程度上反映患者體內的炎性活動程度，對于病情的進展和預后具有重要影響[16]，這一指標亦被作為PD1/PDL1免疫治療療效的評價標準[17]。

本研究發現經過NK細胞輸注后，A組患者NK細胞數量得到明顯提高，NK細胞聯合治療模式下患者功能狀態評分（PS）存在明顯改善，A組PS評分較B組改善有統計學意義（P<0.05）。一方面藥物對腫瘤細胞的遏制和殺傷作用，同時合并有NK細胞的聯合殺傷效應;另一方面NK細胞帶來基礎免疫功能的提高。研究發現傳統的化療藥物引起細胞凋亡，誘發DNA損傷和癌細胞死亡的同時，化療也能誘導腫瘤細胞對免疫效應器的增敏起重要作用，可以調節NK細胞活化或抑制配體在癌細胞上的表達，從而影響NK細胞對其的識別和清除[18，19];西妥昔單抗靶向藥物一方面通過參與級聯信號通路介導腫瘤生長耐藥、轉移、血管生成和凋亡，一方面能夠刺激NK細胞產生細胞因子（如IFN-Y、IL-2），增強殺傷活性，同時可以促進NK細胞與腫瘤細胞接觸，直接殺傷腫瘤細胞[20];體外研究也證實NK細胞聯合西妥昔單抗能夠顯著增加NK細胞殺傷活性[21]。

在結腸癌患者臨床療效方面，A組DCR控制率顯著提高，疾病進展時間（TTP）得到改善，組間中位進展時間有統計學意義（P<0.01），生存函數曲線圖發現A組明顯優于B組，聯合治療模式獲益更大。安全性方面，發熱不適組間沒有顯著差異，3～4級骨髓抑制風險方面A組較B組有顯著降低（P<0.05），很大程度上改善化療的副反應，證實NK細胞聯合治療的綜合模式下帶來了顯著的生存獲益，與前面的研究發現具有一致性[7，13，14]。

不足之處和難點：①NK細胞體外分離和培養存在困難，成本較高，分離純度受到影響;②NK細胞培養周期長，影響因素大，化療周期受到NK細胞培養時間限制，治療存在延遲性;③NK細胞在體內生存時間較短，維持周期短，需要定期連續的輸注，患者定期采血分離培養，依從性較差;④NK細胞治療過程中進入實體瘤困難，往往在血液循環過程中被消耗，腫瘤微環境中細胞數量受到影響。

下一步方向：①尋找可替代的NK細胞系，解決NK細胞培養困難、周期長等問題，研究發現 NK92、NKL、NKG、KHYG-1細胞系有較強的抗腫瘤活性，適用于 NK 細胞所介導的腫瘤免疫治療，目前NK92 是唯一進入臨床試驗段的細胞系[22];②研制能夠穩定表達相關因子的NK細胞系，使NK細胞能夠自分泌或旁分泌細胞因子（如IL-2、IL-12等）作用于NK細胞自身，使其持續擴增和活化[23]。

展望：近年來，嵌合型抗原受體的NK細胞（CarNK細胞）的研發[24-26]快速發展，彌補了NK92細胞缺乏CD16表面抗原不能啟動ADCC效應的應用，拓寬NK細胞的替代治療，促進NK92細胞株聯合單克隆靶向藥物的臨床運用。2018年6月中科大生命科學與醫學部肖衛華教授團隊啟動NK細胞制劑治療多線治療失敗惡性腫瘤的臨床研究;2018年10月美國將NK細胞納入癌癥免疫治療試驗，進一步推動了NK細胞的發展，NK細胞過繼細胞免疫治療在未來有望與PD1/PDL1等免疫治療比肩。

綜上所述，NK細胞聯合化療、靶向治療模式能夠明顯改善晚期結腸癌患者生存質量，延緩腫瘤進展，延長生存期，帶來生存質量的獲益，其安全性值得肯定，一定程度上緩解了化療帶來的副作用。本研究為今后生物綜合治療模式提供了指導性經驗和新的研究方向。NK細胞免疫治療仍具有眾多的開發空間，需要深入研究。

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（收稿日期：2019-03-15）