PPP1R3A基因多態(tài)性與中國維吾爾族人群精神分裂癥關(guān)聯(lián)性研究☆

史新玉 安治國 孫樂樂 徐斌△ 母代斌△ 傅松年△ 胡紅星△ 羅曉 杜雯閆萍 靳路 聶丹 考爾沙爾·艾力木 師詠勇 伊琦忠△○☆

眾多研究認為精神分裂癥（schizophrenia）是一種多基因、復(fù)雜的遺傳性疾病[1-3]，目前已發(fā)現(xiàn)多個基因及位點與該疾病發(fā)生存在關(guān)聯(lián)[4]。現(xiàn)有研究揭示，蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基3A（protein phosphatase 1 regulatory subunit 3A,PPP1R3A）基因是中國漢族人群精神分裂癥遺傳易感基因之一，而針對西方人群精神分裂癥的研究未發(fā)現(xiàn)其關(guān)聯(lián)性[4]。中國維吾爾族人群是比較典型的東西方“混血”人群[5]，早前已有研究報道中國維吾爾族人群精神分裂癥有其獨特的臨床特征[6]和遺傳易感性[7-8]。目前尚未見關(guān)于PPP1R3A基因與中國維吾爾族人群精神分裂癥關(guān)聯(lián)性的研究。為此，本研究采用靶向捕獲二代測序技術(shù)檢測中國維吾爾族精神分裂癥患者PPP1R3A基因外顯子區(qū)域，旨在了解該基因與該人群精神分裂癥病因?qū)W關(guān)聯(lián)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象患者組來自2010-2018年新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及新疆維吾爾族自治區(qū)其他精神衛(wèi)生機構(gòu)住院的維吾爾族精神分裂癥患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition,DSM-Ⅳ）精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；②維吾爾族，三代以上均居住在新疆維吾爾族自治區(qū)；③相互間無血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有神經(jīng)系統(tǒng)疾病或其他嚴(yán)重軀體疾病；②存在物質(zhì)依賴或物質(zhì)成癮；③妊娠期或哺乳期婦女；④患有其他精神疾病或精神發(fā)育遲滯。共收集528例患者，男性308例，女性220例；年齡11～81歲，平均（38.09±11.19）歲。

對照組來自2017-2018年新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心的健康體檢者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①無精神疾病史及家族史；②身體健康；③維吾爾族，三代以上均居住在新疆維吾爾族自治區(qū)；④與患者組及相互間無血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)同患者組。共收集576名對照，男性330名，女性246名；年齡13～84 歲，平均（37.54±12.06）歲。 患者組與對照組性別分布（χ2=0.123,P=0.726）、年齡（t=0.716,P=0.486）差異無統(tǒng)計學(xué)意義。所有納入對象或其監(jiān)護人均知情同意，并簽署知情同意書。本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 自制一般情況調(diào)查表，收集入組被試的人口學(xué)資料，由兩名主治以上職稱的精神科醫(yī)師對患者及監(jiān)護人詢問病史，采用適于DSM-Ⅳ的結(jié)構(gòu)式臨床訪談（structured clinical interview for DSM-Ⅳ,SCID）進行定式精神檢查并診斷，用陽性與陰性癥狀量表（positive and negative symptoms scale,PANSS）評定患者病情嚴(yán)重程度。

1.2.2 DNA提取 采集所有研究對象的肘靜脈血5 mL，EDTA抗凝，-20°C冰箱保存，采用血液基因組DNA提取試劑盒 （Tiangen Biotech Co.Ltd,Beijing,China）提取外周血 DNA，用 NanoDropl000分光光度計對DNA樣本濃度、純度進行測定。樣本需達到吸光度A260/A280大于1.65，濃度高于15 ng/μL，不符合要求的重新提取。提取的DNA放置于-80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PPP1R3A基因外顯子區(qū)域靶向捕獲及測序采用多重PCR靶向捕獲二代測序技術(shù)擴增和檢測PPP1R3A基因外顯子區(qū)域DNA。①配置Phu sion PCR 反應(yīng)體系，包括 Phusion HF buffer（5×）2 μL、10 mmol/L （each）dNTP mix 0.2 μL、10 × primer mix-F 0.1 μL、10× primer mix-R 0.1 μL、Nuclease-free Water 4.4 μL、Phusion Hot Start II polymerase （2 U/μL）0.2 μL、3 μL 基因組 DNA， 快速離心后，在PCR儀按照PCR反應(yīng)條件所要求的溫度和時間進行反應(yīng)；②將上述PCR反應(yīng)液中加入1 μL Exonulease（NEB）吹打混合均勻繼續(xù)在 PCR儀上根據(jù)設(shè)定條件進行反應(yīng)，1.0×AMPure磁珠純化，70%的乙醇洗脫兩遍；③配置第二次PCR反應(yīng)體系， 樣品 DNA 21 μL，Primer i5 2 μL，Primer i7 2 μL，2× KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25 μL，設(shè)置PCR反應(yīng)條件進行反應(yīng)；④樣品各取5 μL合并，取100 μL進行純化；⑤終產(chǎn)物經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOne進行片段大小及濃度的檢測，最后終產(chǎn)物使用二代高通量測序儀Illumina HiSeq X Ten（美國Illumina公司）測序。

1.2.4 測序數(shù)據(jù)分析 在開始序列比對之前，使用FASTQC質(zhì)控軟件對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量檢查和預(yù)處理，隨后運用 BWA軟件（http：//bio-bwa.sourceforge.net/）比對和定位到參考序列上（GRCh37/Hg19），隨后使用 Picard軟件、GATK 軟件（https：//software.broadinstitute.org/gatk/）檢測DNA擴增產(chǎn)物多態(tài)性位點，對單核苷酸變異（single nucleotide variation,SNV）和插入缺失突變（insertions and deletions,Indels）等數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，用ANNOVAR軟件將突變位點注釋到特定的數(shù)據(jù)庫 （1000 Genome,ESP6500,ExAC,SIFT/PolyPhen）中，對得到的突變信息進行過濾，獲得變異位點。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。兩組年齡、性別比較分別采用獨立樣本t檢驗和χ2檢驗，男女患者PANSS量表評分比較采用獨立樣本t檢驗。利用PLINK軟件平臺，患者組與對照組基因分布頻率的Hardy-Weinberg遺傳平衡度檢驗采用χ2檢驗，兩組間等位基因和基因型分布比較采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各性別患者病情嚴(yán)重程度患者組中男性和女性的PANSS陽性癥狀、陰性癥狀、一般精神病理學(xué)癥狀量表分及總分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見表 1）。

表 1 男性與女性患者PANSS量表評分

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡度檢驗通過高通量測序，共獲得PPP1R3A基因rs1800000、rs1799999、rs8192686等3個變異位點。各位點在兩組中分布符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0.05），樣本具有一定的代表性。

2.3 PPP1R3A基因rs1800000位點等位基因及基因型頻率患者組與對照組間等位基因（χ2=13.305,P=0.001）和基因型（χ2=19.312,P=0.001）頻率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。按性別分亞組，男性患者組與男性對照組間等位基因（χ2=6.874,P=0.009）和基因型（χ2=11.706,P=0.003）頻率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；女性患者組與女性對照組間等位基因（χ2=6.422,P=0.011）和基因型（χ2=8.048,P=0.018）頻率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（見表2）。

表2 患者組與對照組及不同性別亞組rs1800000位點等位基因與基因型頻率

2.4 PPP1R3A基因rs1799999位點等位基因及基因型頻率患者組與對照組間等位基因（χ2=1.006,P=0.316）和基因型（χ2=1.523,P=0.467）頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。按性別分亞組，男性患者組與男性對照組間等位基因（χ2=0.002,P=0.963）和基因型（χ2=1.244,P=0.537）頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；女性患者組與女性對照組間等位基因頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.188,P=0.139），基因型頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.564,P=0.038）（見表3）。

2.5 PPP1R3A基因rs8192686位點等位基因及基因型頻率患者組與對照組間等位基因（χ2=1.190,P=0.275）和基因型（χ2=1.203,P=0.548）頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。按性別分亞組，男性患者組與男性對照組間等位基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.625,P=0.032），基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.697,P=0.096）；女性患者組與女性對照組間等位基因（χ2=0.515,P=0.473）和基因型（χ2=0.673,P=0.714）頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（見表4）。

表3 患者組與對照組及不同性別亞組rs1799999位點等位基因與基因型頻率

表4 患者組與對照組及不同性別亞組rs8192686位點等位基因與基因型頻率

3 討論

PPP1R3A基因編碼骨骼肌特異糖原靶向調(diào)節(jié)亞基，該基因位于染色體7q31.1，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子。PPP1R3A基因或蛋白質(zhì)序列改變與2型糖尿病等多種代謝性疾病相關(guān)[9-11]，研究也發(fā)現(xiàn)該基因與精神分裂癥存在關(guān)聯(lián)性。LI等[4]納入36180名研究對象，進行中國漢族人群精神分裂癥全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study,GWAS）及驗證，同時結(jié)合精神疾病基因組聯(lián)盟（Psychiatric Genomics Consortium,PGC2）的歐洲樣本數(shù)據(jù)，開展大樣本跨種族分析以及精細定位研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因與中國漢族精神分裂癥存在關(guān)聯(lián)性，而在歐洲精神分裂癥人群中沒有發(fā)現(xiàn)其關(guān)聯(lián)性。

本研究發(fā)現(xiàn)PPP1R3A基因rs1800000位點等位基因及基因型頻率分布在中國維吾爾族人群精神分裂癥和對照組間存在統(tǒng)計學(xué)差異，提示該基因位點可能是中國維吾爾族人群精神分裂癥致病基因及位點之一；而rs1799999位點可能與中國維吾爾族女性精神分裂癥的發(fā)病有關(guān)聯(lián)性；該基因上的rs8192686位點C等位基因可能與中國維吾爾族男性精神分裂癥發(fā)病相關(guān)。這些結(jié)果說明PPP1R3A基因可能是中國漢族和中國維吾爾族精神分裂癥人群共同致病基因之一。基因在不同人群及地域中存在遺傳異質(zhì)性，中國維吾爾族人群遺傳學(xué)特征介于中國漢族人群和歐洲人群之間[5]，既往研究發(fā)現(xiàn)中國維吾爾族精神分裂癥患者和中國漢族精神分裂癥患者在臨床表現(xiàn)和遺傳學(xué)上存在差異[6,12-13]，提示臨床和基礎(chǔ)研究中應(yīng)給予關(guān)注。

綜上，PPP1R3A基因可能是中國漢族和中國維吾爾族精神分裂癥的共同致病基因之一。本次研究仍存在一些不足，如未能對新發(fā)現(xiàn)的rs1800000、rs1799999、rs8192686基因位點開展進一步蛋白組學(xué)及功能方面的研究。未來需繼續(xù)擴大樣本量，同時結(jié)合蛋白組學(xué)及功能學(xué)研究，更深入地探討PPP1R3A基因在中國維吾爾族人群精神分裂癥病因及發(fā)病機制中的作用。