銅離子與Tris相互作用對ITC實驗的影響

江志玲

摘 要：本實驗通過純水配制的不同濃度的銅離子溶液滴定Tris緩沖液、Tris緩沖液反滴定純水配制的銅離子溶液和純水、Tris緩沖液配制的銅離子溶液滴定Tris緩沖液三個方面的實驗說明了銅離子和 Tris緩沖液相互作用產(chǎn)生了放熱反應(yīng)，且平衡結(jié)合比約是1：50，低濃度銅離子溶液反應(yīng)不明顯，所以在應(yīng)用ITC進(jìn)行金屬離子的實驗中，避免使用Tris緩沖液來接觸銅離子，以其他緩沖液代替常用的Tris緩沖液。如果不可避免要使用Tris緩沖液，就要控制銅離子在低濃度，由本實驗結(jié)果得知，最好不要超過0.8mM，以此來減少實驗誤差。

關(guān)鍵詞：熱力學(xué) ；絡(luò)合反應(yīng)；等溫滴定量熱 ；應(yīng)用進(jìn)展

1等溫滴定微量熱ITC

ITC，即等溫滴定微量熱，近年來該方法在研究絡(luò)合物的形成或離解的生物物理方法等方面發(fā)揮了非常巨大的作用。它以其非特異性的獨特優(yōu)勢，由靈敏度和自動化都非常高的微量量熱儀，準(zhǔn)確、連續(xù)地監(jiān)測和記錄一個化學(xué)變化過程的量熱曲線，應(yīng)用非常廣泛，可以在線、原位和無損傷地同時提供動力學(xué)和信息熱力學(xué)信息[1]。該方法不需要熒光標(biāo)記，速度很快[2]。

ITC在像藥物核酸相互作用、酶促反應(yīng)、蛋白質(zhì)去折疊/折疊、抗原抗體相互作用等很多方面都有應(yīng)用到。

很多ITC應(yīng)用領(lǐng)域都是會用到常用的Tris緩沖液，而我們在研究金屬離子和蛋白質(zhì)實驗中發(fā)現(xiàn)，很多金屬離子在ITC實驗中進(jìn)行滴定時沒有什么明顯反應(yīng)，但是銅離子在進(jìn)行ITC實驗滴定時卻反應(yīng)很是強烈。那么究竟是銅離子和實驗反應(yīng)物有特殊放熱反應(yīng)呢？還是銅離子和ITC實驗中常用的Tris緩沖液有什么作用呢？為此我們展開了相關(guān)研究。

Tris有一個氨基，Cu2+和氨基結(jié)合通常有放熱反應(yīng)。

2.實驗過程

實驗材料：Tris緩沖液（1mM Tris緩沖液，10mM Tris緩沖液）；金屬離子溶液，不同濃度的CuCl2（0.01mM CuCl2，1mM CuCl2，由Tris緩沖液配制）；0.01mM CuCl2純水溶液。

Tris緩沖液和金屬離子溶液的配置

0.01 M Tris pH 7.4：稱取10ml 0.1mol/L Tris堿溶液加入到盛有1L蒸餾水的燒杯中，加42ml 0.1mol/ml HCl調(diào)整PH至7.4（注意充分?jǐn)嚢杈鶆颍叢僮鳎厹y量溶液的PH值。），加水將體積調(diào)至1L。（Tris溶于水。所以用水溶解Tris。通常用Tris配制成0.1mol/L的溶液。然后根據(jù)需要量取一定體積的這種溶液，向其中加入0.1mol/L濃度的鹽酸，充分?jǐn)嚢瑁S時測其PH值，達(dá)到需要值即可。）

0.01mM CuCl2純水溶液的配制：稱取1.35mg氯化銅粉末，溶解在1L純水中配制出0.01mM 的CuCl2純水溶液。

2.1.3 實驗儀器

等溫滴定微量熱儀

等溫全定量熱ITC是測量任何兩個相互作用分子的親和力和熱力學(xué)的有力分析工具。ITC被認(rèn)為是測試和諧力量的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。

1.用純水配置1mMCuCl2溶液滴定1mM Tris緩沖液的ITC實驗；

（1）.明顯看出剛開始放熱反應(yīng)很明顯，達(dá)到某一個點后明顯趨于緩和，可以看出這里有一個宏觀動態(tài)平衡結(jié)合比，n=0.0203時大約是1個銅離子結(jié)合50分子Tris時，達(dá)到吸附比平衡。

2.用10mM Tris緩沖液反滴定0.01mM CuCl2純水溶液和純水的ITC實驗；

（1）Tris緩沖液反滴定純水時也有微弱的放熱反應(yīng)，但是變化很小很小，幾乎可以忽略不計。不是由于純水或者其他什么，確實是銅離子和Tris緩沖液相互作用產(chǎn)生了放熱反應(yīng)。

3.用Tris緩沖液配置不同濃度的CuCl2溶液滴定Tris緩沖液的ITC實驗；

（1）銅離子濃度在0.2、0.4、0.6mM的時候，基本沒有熱量變化，0.8mM放熱反應(yīng)也不明顯，但1mM的時候，有明顯的放熱反應(yīng)，這說明在0.8和1mM之間存在著一個反應(yīng)躍變，推測臨界點后銅離子過剩，過剩的銅離子和Tris緩沖液作用，產(chǎn)生了放熱反應(yīng)。

本實驗在數(shù)據(jù)分析中解釋闡明了關(guān)于金屬離子銅離子和Tris緩沖液有結(jié)合熱，其相互作用對ITC實驗有明顯放熱的影響，然后提出了避免這些問題的方法，那就是在應(yīng)用ITC進(jìn)行金屬離子的實驗中，避免使用Tris緩沖液來接觸銅離子，以其他緩沖液（如MES、HEPES、MOPS）代替常用的Tris緩沖液。如果不可避免要使用Tris緩沖液，就要控制銅離子在低濃度，由本實驗結(jié)果得知，最好不要超過0.8mM，以此來減少實驗誤差。

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