性別及日齡對轉人神經生長因子基因小鼠唾液中蛋白分泌的影響

廖莎，朱慶春，吳珍芳，李紫聰，曾芳,2

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性別及日齡對轉人神經生長因子基因小鼠唾液中蛋白分泌的影響

廖莎1，朱慶春1，吳珍芳1，李紫聰1，曾芳1,2

1 華南農業大學 動物科學學院，廣東 廣州 510642 2 華南農業大學 海洋學院，廣東 廣州 510642

神經生長因子 (Nerve growth factor，NGF) 是一種能促進神經元發育、分化、再生的蛋白。為高效生產藥效更佳的人源NGF (hNGF) 藥物，最近，筆者實驗室構建出唾液腺特異表達hNGF的轉基因小鼠，并從該轉基因小鼠唾液中純化獲得具有高生物學活性的hNGF蛋白。為了選擇性別和日齡最適宜的轉hNGF基因小鼠用于收集純化hNGF蛋白，文中比較了28日齡 (性成熟前) 雄性、雌性，63日齡 (性成熟后) 雄性、雌性轉hNGF基因小鼠，共4組轉hNGF基因小鼠分泌的唾液量、唾液總蛋白量、唾液鼠源NGF (mNGF) 蛋白量和唾液hNGF蛋白量等指標。結果顯示，63日齡的轉hNGF基因小鼠分泌的唾液量、唾液總蛋白量、唾液mNGF蛋白量和唾液hNGF蛋白量顯著高于28日齡同一性別的轉hNGF基因小鼠，且63日齡的雄性轉hNGF基因小鼠分泌的唾液hNGF蛋白量顯著高于同一日齡的雌性轉hNGF基因小鼠；在4組小鼠中，63日齡的雄性轉hNGF基因小鼠分泌的唾液hNGF含量最高，比28日齡雌性轉hNGF基因小鼠高出約46倍，最適宜用于收集唾液并從中純化hNGF。

轉基因小鼠，性別，日齡，人神經生長因子，唾液

神經生長因子 (Nerve growth factor，NGF) 是一種具有神經元營養和促進突起生長的神經細胞生長調節因子。它對中樞及周圍神經元的各種生理過程具有重要的調控作用。NGF在1952年被首次發現[1]，后續研究證明，NGF對治療各種神經損傷或退行性疾病具有明顯的效果[2]。由于對NGF的發現和研究作出了巨大的貢獻，生物學家Cohen和Levi-Montalcini獲得了1986年的諾貝爾醫學生理獎[3-4]。從2002年至今，中國政府已批準4種NGF藥物 (商品名分別為恩經復、蘇肽生、金路捷和麗康樂) 上市用于治療人類神經相關疾病，該4種藥物均提取自小鼠唾液腺，屬于鼠源NGF (mNGF)，且該類藥物目前的價格非常昂貴，約1萬元/mg。雖然mNGF與人NGF (hNGF) 同源性高[5]，且對人類神經相關疾病具有確實療效，但mNGF用于人類疾病治療仍然存在免疫原性問題[6]。且已有研究表明，mNGF活性比hNGF低[7]，所以非常有必要研發hNGF藥物。

迄今為止，有不少研究嘗試利用各種方法來制備hNGF，如利用大腸桿菌表達系統[8-9]、酵母表達系統[10]、昆蟲[11-12]或哺乳動物細胞[13-14]表達系統等，但因為上述表達系統存在翻譯后修飾缺陷、產量低、成本高等問題而達不到理想效果。還有研究利用轉基因兔乳腺作生物反應器制備hNGF[15]。但乳腺生物反應器存在性別和表達時期的限制，即必須在雌性動物的泌乳期才能表達目的蛋白，且乳中蛋白量及種類繁多，不利于純化目的蛋白。許多動物在唾液腺中高水平表達高活性的內源NGF，這說明，動物唾液腺是NGF蛋白合成的理想場所。此外，以動物唾液腺作生物反應器表達外源蛋白還不受性別和表達時期的限制，且唾液中蛋白量及種類較少，有利于外源蛋白純化。基于動物唾液腺的以上優點，本實驗室曾芳等[16]已生產出唾液腺特異表達hNGF的轉基因小鼠，并從其唾液中純化獲得了比mNGF有更高生物活性的hNGF蛋白，但該轉基因小鼠的hNGF蛋白平均產量仍有待提高。

已有研究表明，小鼠唾液中的NGF蛋白分泌量存在明顯的性別差異，雄性小鼠唾液腺中NGF的mRNA表達量顯著高于雌性小鼠，且雄性小鼠唾液中的NGF蛋白量顯著高于雌性小鼠，同時研究數據顯示，成年 (56日齡以上) 雄鼠下頜唾液中NGF濃度顯著高于幼年 (30日齡左右) 雄性小鼠[17-18]。另有研究表明，小鼠子宮組織中的NGF表達量隨日齡增加而增加，在30日齡達到峰值，成年后維持在一定水平[19]；陸璐等[20]研究發現新生小鼠頜下腺不表達NGF，雄性小鼠2周齡左右才檢測到NGF的表達信號，此后隨日齡的增加而增加，1月齡左右時雄性小鼠頜下腺中NGF的mRNA迅速增多，到2月齡時NGF的mRNA持續保持較高水平轉錄。這些研究說明性別和日齡會影響小鼠NGF的表達量。

為了選擇合適日齡及合適性別的轉hNGF基因小鼠用于高效收集唾液并純化hNGF蛋白，文中研究了性別和日齡對轉hNGF基因小鼠唾液蛋白分泌的影響。為后續從轉hNGF基因小鼠唾液中高效生產hNGF藥物提供有利參考。

1 材料與方法

1.1 轉基因小鼠的配種擴繁

8周齡的C57BL-6品系野生型雌性小鼠購自廣東省醫學實驗動物中心，飼養5 d度過適應期后，每只注射7.5 IU的PMSG激素 (購自寧波第二激素廠)，48 h后每只注射7.5 IU的HCG激素 (購自寧波第二激素廠)[21]，注射后與10周齡的C57BL-6品系的轉hNGF基因雜合子雄性小鼠[16]按2∶1合籠，次日清晨檢查陰道栓，將有栓雌鼠挑出分籠待產。

1.2 轉基因小鼠的綠色熒光表達鑒定

新生小鼠在出生后第3日齡進行綠色熒光表達鑒定。在黑暗環境中用熒光燈 (BLS公司，中國) 照射小鼠，通過濾光眼鏡觀察，在熒光燈照射下發出綠色熒光的則為轉基因小鼠。將轉基因小鼠和野生型小鼠放在一起，在自然光下和藍色熒光燈照射下分別用不加濾光片和加了濾光片的相機拍攝照片。

1.3 轉基因小鼠的PCR鑒定

小鼠在25日齡打耳標后剪取長度約為5 mm的尾巴組織置于去DNA酶的1.5 mL離心管中，使用Omega公司的組織DNA提取試劑盒，按照其說明書進行小鼠尾樣DNA抽提，抽提完成后，用微量核酸濃度儀 (Nanodrop 2000，Thermo，美國) 測定DNA樣品濃度，放于?20 ℃冰箱保存。用PCR對轉基因小鼠進行基因型檢測 (PCR儀為美國Life公司)。hNGF基因擴增引物為5′-AGC TGTGGAAGCTGGTGTTCCTG-3′、5′-CAGCTTC ACGGGGAGGCTG-3′，內參基因GAPDH的擴增引物為5′-CTCCCACTCTTCCACCTTCG-3′、5′-C CACCACCCTGTTGCTGTAG-3′ (設計軟件：Primer Premier 6.0，由北京華大基因公司合成)，產物長度分別為290 bp和110 bp。轉基因小鼠DNA可以擴增出內參基因片段和hNGF基因片段，而野生型小鼠DNA只能擴增出內參基因片段。PCR試劑購自廣州東盛生物科技公司。

1.4 小鼠唾液采集

根據日齡、性別及基因型將小鼠分成4組，分別為28日齡轉基因雄性、28日齡轉基因雌性、63日齡轉基因雄性、63日齡轉基因雌性，每組4只。每只小鼠腹腔共注射氯胺酮 (劑量按每克體重25 μg) 和甲苯噻嗪 (劑量按每克體重1.1 μg) 進行麻醉[16]，麻醉后用移液槍吸取 (每只小鼠吸取20 min) 小鼠口腔分泌的唾液放入離心管中[22]，放?80 ℃冰箱保存備用。

1.5 小鼠唾液總蛋白檢測

將采集好的小鼠唾液適當稀釋，使用康為世紀生物科技公司生產的BCA蛋白濃度測定試劑盒，按照其說明書對唾液中的總蛋白濃度進行測定。用酶標儀 (美國伯騰儀器有限公司，型號：Synergy H1) 在540–590 nm范圍內測定BSA標準品和每個樣品的吸光值，繪制標準曲線，計算唾液樣品中的總蛋白濃度。

1.6 酶聯免疫吸附測定法 (ELISA) 檢測分析

將采集好的小鼠唾液適當稀釋后，使用小鼠β-NGF ELISA試劑盒和人β-NGF ELISA試劑盒 (均購自武漢尹艾博科技有限公司) 分別對轉基因小鼠唾液中mNGF蛋白和hNGF蛋白濃度進行測定。用酶標儀 (美國伯騰儀器有限公司，型號：Synergy H1) 測定樣品吸光值，繪制標準曲線，計算唾液樣品中的mNGF蛋白和hNGF蛋白濃度。

1.7 統計分析

在Excel表中計算出蛋白濃度及其標準差等數據，并繪制柱狀圖，利用IBM SPSS Statistics 21進行顯著性分析，比較同一性別不同日齡以及相同日齡、不同性別轉基因小鼠的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 轉hNGF基因小鼠綠色熒光表達及PCR鑒定

熒光燈照射檢測顯示，轉hNGF基因小鼠有明顯熒光表達，而野生型小鼠則無熒光表達 (圖1A)；PCR檢測顯示，轉hNGF基因小鼠基因組中攜帶hNGF基因，而野生型小鼠基因組中無hNGF基因 (圖1B)。熒光燈照射檢測結果與PCR檢測結果完全一致。

2.2 性別及日齡對轉hNGF基因小鼠唾液分泌量的影響

28日齡的轉hNGF基因雄鼠與雌鼠唾液分泌量差異不顯著，且63日齡的轉hNGF基因雄鼠與雌鼠唾液分泌量也無顯著差異；63日齡的轉hNGF基因雄鼠與雌鼠唾液分泌量都極顯著高于28日齡的同一性別轉hNGF基因小鼠 (圖2)。

2.3 性別及日齡對轉hNGF基因小鼠唾液中總蛋白分泌的影響

28日齡的轉hNGF基因雄鼠與雌鼠唾液中總蛋白濃度之間差異不顯著，63日齡轉hNGF基因雄鼠與雌鼠唾液中總蛋白濃度之間差異也不顯著，即同一日齡不同性別的轉hNGF小鼠唾液中總蛋白濃度均無顯著差異；63日齡的轉hNGF基因雄鼠與雌鼠唾液中總蛋白濃度都極顯著高于28日齡中同一性別的轉hNGF基因小鼠 (圖3A)。

圖1 轉hNGF基因小鼠鑒定(A：轉hNGF基因小鼠熒光表達鑒定；B：轉hNGF基因小鼠PCR鑒定)

圖2 性別和日齡對轉hNGF基因小鼠唾液分泌量的影響

28日齡的轉hNGF基因雄鼠與雌鼠唾液中總蛋白量之間差異不顯著，63日齡的轉hNGF基因雄鼠與雌鼠唾液中總蛋白量之間差異也不顯著，即同一日齡的不同性別的轉hNGF基因小鼠唾液中總蛋白量均無顯著差異；63日齡的轉hNGF基因雄鼠與雌鼠唾液中總蛋白量都極顯著高于28日齡的同一性別轉hNGF基因小鼠 (圖3B)。

2.4 性別及日齡對轉hNGF基因小鼠唾液中mNGF蛋白分泌的影響

轉hNGF基因小鼠唾液中mNGF蛋白的分泌情況與同日齡、同性別的野生型(WT)小鼠唾液中的mNGF蛋白分泌情況差異均不顯著 (圖4)。

28日齡的轉hNGF基因雄鼠與雌鼠唾液中mNGF蛋白濃度差異不顯著，但63日齡的轉hNGF基因雄鼠唾液中mNGF蛋白濃度極顯著高于63日齡的轉hNGF基因雌鼠；63日齡的轉hNGF基因雄鼠唾液中mNGF蛋白濃度極顯著高于28日齡的轉hNGF基因雄鼠，但63日齡與28日齡的轉hNGF基因雌鼠唾液中mNGF蛋白濃度之間差異不顯著；不同日齡且同一性別的野生型小鼠中，63日齡小鼠唾液mNGF蛋白濃度均高于28日齡，但雄性差異不顯著，而雌性差異極顯著；同一日齡不同性別的野生型小鼠中，雄鼠唾液mNGF蛋白濃度均高于雌鼠，但在63日齡時差異顯著(圖4A)。

28日齡的轉hNGF基因雄鼠與雌鼠唾液中mNGF蛋白相對濃度無顯著差異，但63日齡的轉hNGF基因雄鼠唾液中mNGF蛋白相對濃度極顯著高于63日齡的轉hNGF基因雌鼠；63日齡與28日齡同一性別的轉hNGF基因小鼠唾液中mNGF蛋白相對濃度差異不顯著；同日齡不同性別的野生型小鼠中，雄性唾液mNGF相對濃度均大于雌性，但在63日齡差異顯著；而同一性別不同日齡的野生型小鼠唾液mNGF蛋白相對濃度差異均不顯著 (圖4B)。

28日齡的轉hNGF基因雄鼠與雌鼠唾液中mNGF蛋白含量無顯著差異，但63日齡的轉hNGF基因雄鼠唾液中mNGF蛋白含量極顯著高于63日齡的轉hNGF基因雌鼠；63日齡的轉hNGF基因雄鼠與雌鼠唾液中mNGF蛋白含量極顯著高于28日齡的同一性別轉hNGF基因小鼠；同一日齡不同性別的野生型小鼠中，雄性唾液mNGF蛋白含量均高于雌性，但在63日齡時差異顯著；同一性別不同日齡的野生型小鼠中，63日齡小鼠唾液mNGF蛋白含量均極顯著地高于28日齡小鼠唾液mNGF蛋白含量 (圖4C)。

2.5 性別及日齡對轉hNGF基因小鼠唾液中hNGF蛋白分泌的影響

28日齡和63日齡的轉hNGF基因雄鼠唾液中hNGF蛋白濃度都顯著高于同一日齡的轉hNGF基因雌鼠；63日齡的轉hNGF基因雄鼠唾液中hNGF蛋白濃度顯著高于28日齡的轉hNGF基因雄鼠；28日齡和63日齡的轉hNGF基因雌鼠唾液中hNGF蛋白濃度無顯著差異 (圖5A)。

28日齡和63日齡的轉hNGF基因雄鼠唾液中hNGF蛋白相對濃度都高于同一日齡的轉hNGF基因雌鼠，差異顯著；28日齡與63日齡同一性別轉hNGF基因小鼠唾液中hNGF蛋白相對濃度差異不顯著 (圖5B)。

28日齡和63日齡的轉hNGF基因雄鼠唾液中hNGF蛋白含量都高于同一日齡的轉hNGF基因雌鼠，差異顯著；63日齡的轉hNGF基因雄鼠和雌鼠唾液中hNGF蛋白含量都高于28日齡的同一性別的轉hNGF基因小鼠，差異極顯著(圖5C)。

圖5 性別及日齡對轉hNGF基因小鼠唾液中hNGF蛋白分泌的影響(A：轉基因小鼠唾液中hNGF蛋白的濃度；B：轉基因小鼠唾液中hNGF蛋白相對濃度；C：轉基因小鼠唾液中hNGF蛋白的含量)

3 討論

本研究結果顯示，性別對轉hNGF基因小鼠在28和63日齡分泌的唾液量、唾液總蛋白濃度、唾液總蛋白量無顯著影響；對轉hNGF基因小鼠在63日齡分泌的唾液mNGF蛋白濃度、相對濃度及總量均有顯著影響，且雄性高于雌性；對轉hNGF唾液hNGF蛋白濃度、相對濃度及總量都有顯著影響，且雄性高于雌性。

本研究結果還顯示，日齡對同一性別的轉hNGF基因小鼠分泌的唾液量、唾液總蛋白濃度、唾液總蛋白量都有顯著影響，且均為63日齡高于28日齡；對雄性轉hNGF基因小鼠分泌的唾液mNGF蛋白濃度有顯著影響，且63日齡高于28日齡；對同一性別的轉hNGF基因小鼠分泌的唾液mNGF蛋白總量有顯著影響，且63日齡高于28日齡；對雄性轉hNGF基因小鼠分泌的唾液hNGF蛋白濃度有顯著影響，且63日齡高于28日齡；對同一性別的轉hNGF基因小鼠分泌的唾液hNGF蛋白總量有顯著影響，且63日齡高于28日齡。

已有研究顯示雄性小鼠唾液中NGF蛋白濃度顯著高于雌性[16]，這與本研究結果相似。此外，還有研究顯示雄性成年小鼠唾液腺中的NGF含量是雌性成年小鼠的10倍左右，而去勢后的雄性成年小鼠唾液腺中的NGF含量則與雌性成年小鼠相當，用甲狀腺激素和雄激素治療后的去勢雄性成年小鼠唾液腺中NGF含量分別增加6倍和20倍，且后者基本恢復至去勢前的量[23]。劉玲愛等[24]也證明，通過注射外源雄激素可以有效提高小鼠唾液腺NGF的合成量。上述研究結果顯示雄性激素在小鼠體內可以促進NGF蛋白的表達合成。這也提示我們，可以通過注射外源雄激素來提高轉hNGF基因小鼠唾液中hNGF蛋白的分泌量，從而更高效生產hNGF蛋白。

本研究結果還顯示，同一性別的轉hNGF基因小鼠在63日齡分泌的唾液mNGF和hNGF蛋白總量均顯著高于28日齡，說明hNGF基因小鼠分泌的唾液mNGF和hNGF蛋白總量隨日齡增加而增加，這與另一研究報道的結果一致[20]。由于小鼠唾液蛋白的表達分泌主要受激素 (例如性激素) 調控，隨著日齡的增加，小鼠體內的性激素含量也增加，可能就導致其唾液中NGF蛋白表達分泌增加[25-26]。

根據本研究結果，如果選擇63日齡左右 (性成熟后) 的雄性轉hNGF基因小鼠采集其唾液純化hNGF蛋白，與選擇28日齡 (性成熟前) 的雌性轉hNGF基因小鼠相比，hNGF蛋白產量將提高約46倍。

綜上所述，性別和日齡均對轉hNGF基因小鼠唾液中的hNGF蛋白表達分泌量有顯著影響。選擇性成熟后的雄性轉hNGF基因小鼠收集唾液純化hNGF蛋白，將有利于提高該蛋白的制備效率。

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Effects of gender and age on protein secretion in saliva of transgenic mice expressing human nerve growth factor

Sha Liao1, Qingchun Zhu1, Zhenfang Wu1, Zicong Li1, and Fang Zeng1,2

1 College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China 2 College of Marine Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China

Nerve growth factor (NGF) can promote the development, differentiation and regeneration of neurons. Recently, in order to efficiently produce human NGF (hNGF) drugs with better efficacy, we created transgenic mice expressing hNGF specifically in their salivary glands, and purified highly active hNGF protein from their saliva. Some studies reported that the NGF secretion in mouse saliva is affected by gender and age. Here, in order to select hNGF transgenic mice with high NGF secretion for saliva collection and hNGF purification, we divided transgenic mice into 4 groups, including 28-day-old young males and females, 63-day-old adult males and females. We compared their saliva volume, total salivary protein amount, salivary mNGF protein amount and salivary hNGF protein amount. The results showed that the saliva volume as well as amounts of total salivary protein, salivary mNGF protein and salivary hNGF protein secreted by 63-day-old transgenic mice were significantly higher than those secreted by sex-match 28-day-old transgenic mice, and the salivary hNGF protein amount secreted by male transgenic mice at the age of 63 days was significantly higher than that of female transgenic mice at the same age; Among 4 groups of mice, 63-day-old male transgenic mice secreted the highest salivary hNGF content, which was about 46 times higher than that secreted by the 28-day-old female transgenic mice. Therefore, 63-day-old male transgenic mice should be selected for saliva collection and hNGF purification.

transgenic mice, gender, age, human nerve growth factor, saliva

November 12, 2018;

February 27, 2019

National Natural Science Foundation of China (No. 31601911).

Fang Zeng. Tel: +86-20-85284985; Fax: +86-20-85280369; E-mail: zengf8210@163.com

國家自然科學基金(No. 31601911)資助。

2019-03-19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190318.1121.001.html

10.13345/j.cjb.180467

廖莎, 朱慶春, 吳珍芳, 等. 性別及日齡對轉人神經生長因子基因小鼠唾液中蛋白分泌的影響. 生物工程學報, 2019, 35(6): 1041–1049.

Liao S, Zhu QC, Wu ZF, et al. Effects of gender and age on protein secretion in saliva of transgenic mice expressing human nerve growth factor. Chin J Biotech, 2019, 35(6): 1041–1049.

(本文責編 陳宏宇)