β-防御素130在大腸桿菌中的串聯表達、純化及生物活性分析

藺艷君，董彬

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β-防御素130在大腸桿菌中的串聯表達、純化及生物活性分析

藺艷君1,2，董彬1

1 濱州學院 生物與環境工程學院 山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心，山東 濱州 256603 2 濱州學院 藝術學院，山東 濱州 256603

為了研究抗菌肽β-防御素130的生物學活性和實現大規模制備，通過改良其分子結構，構建表達載體pET28a-3×β-defensin130，利用大腸桿菌BL21 (DE3) 作為宿主細胞誘導表達后為水溶性蛋白。對純化后抗菌肽進行抑菌實驗、穩定性實驗、MTT實驗和溶血性實驗確定其生物活性。最終成功制備出25 kDa的重組蛋白，對金黃色葡萄球菌 (ATCC 25923)(45 μg/mL) 和單增李斯特菌 (ATCC 221633) (80 μg/mL) 等革蘭氏陰性和陽性菌都表現出極強的抗菌活性，且其抗菌活性不受溫度、pH值和蛋白酶消化等影響，MTT細胞毒性實驗顯示其對HEK293細胞無毒性且對兔源紅細胞具有極低的溶血性。這將為新型抗菌肽的開發提供理論基礎并推動抗生素替代產業快速發展。

防御素，抗菌肽，原核表達，蛋白純化，抗菌活性

抗生素濫用導致的耐藥性目前已成為一個嚴重的公共健康問題，近年來，“超級細菌”等事件的發生更顯示出這一問題的嚴重性。因此，尋找和開發新型高效抗生素替代品將是解決這一問題的必然選擇。抗菌肽 (Antimicrobial peptides，AMPs) 是一類具有廣譜抗菌性，能抗真菌、病毒、寄生蟲、革蘭氏陽性和陰性菌的小分子多肽類物質，其最受矚目的特性是不易產生耐藥性[1-4]。目前，已從哺乳動物、植物、無脊椎動物等不同物種中鑒定出2 800多個AMPs，其中大多數AMPs含有5–100個氨基酸[5]。防御素是富含半胱氨酸的一類陽離子多肽，主要包含α、β和θ這3個亞基家族。大多數防御素包含18–50個氨基酸，在免疫系統抵御外來感染侵略過程中發揮著重要作用。目前，通過計算機搜尋策略鑒別出的β-防御素人源編碼基因有28個。β-防御素130于2014年發現[6]，在人源巨噬細胞中表達，已經證實在巨噬細胞消除瘧原蟲抵抗瘧疾的過程中有重要作用。由于在巨噬細胞中的含量較低，提取和純化難度較大，無法進行大規模制備，導致對β-防御素130的制備和功能研究報道不多。

目前，為了改善抗菌肽的抗菌功能，常利用不同來源的宿主細胞進行蛋白的重組表達，例如大腸桿菌、畢赤酵母和萊茵衣藻等[7-9]。除此之外，將抗菌肽進行串聯表達也是提高抗菌肽活性的一種策略。Fuquan Hu實驗室[10]成功將8個hPAB-β在大腸桿菌中實現串聯表達，我們在之前的研究[9]中，利用萊茵衣藻成功表達了3個拷貝的Mytichitin-A，結果均顯示串聯抗菌肽具有更好的抗菌效果和抗菌譜。

與傳統的提取分離方法相比，基因工程法是一種高效的大規模生產方法，大腸桿菌具有DNA操作簡單、培養成本低、表達量高、生產時間短等優點，有利于蛋白質表達等優勢。在本研究中，選用大腸桿菌作為宿主細胞，表達含有3拷貝的β-防御素130 DNA編碼序列。隨后，用Ni柱進行親和純化，分析其抗菌活性、溶血活性、細胞毒性和穩定性。為新型抗菌肽的開發提供理論基礎并推動抗生素替代產業快速發展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞和質粒

大腸桿菌XL1-blue、BL21 (DE3) 感受態細胞、HEK293細胞和pET28a質粒均為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

限制性內切酶、DNA連接酶、DNA分子量marker和蛋白marker等均購自美國Thermo Fisher公司；Ni SepharoseTM6 Fast Flow蛋白純化介質購自美國GE Healthcare公司；NC膜購自北京索來寶公司；His抗體購自美國Sigma-Aldrich公司，HRP標記的羊抗兔抗體購自北京康為世紀公司。木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶購自北京索萊寶公司。其他常規試劑均購自北京索來寶公司。

1.1.3 儀器

超聲波細胞破碎儀 (寧波新芝，JY98-IIIDN)；恒溫搖床 (天津歐諾，JNY-110B)；核酸微量測定儀 (德國Eppendorf，BioSpectrometer D30)；瓊脂糖水平電泳儀 (北京六一，DYCP-32B)；臺式高速離心機 (德國Eppendorf，5424)；高速冷凍離心機 (美國Thermo Fisher, Sorvall ST8R)；蛋白垂直電泳儀、蛋白轉膜儀 (北京六一，DYCZ-24KF、DYCZ-40K)；凝膠成像儀 (上海勤翔，GenoSens 1860)；酶標儀 (南京德鐵，HBS-1096A)。

1.2 方法

1.2.1pET28a-3×β-防御素130載體構建

β-防御素130的編碼基因序列為ATGTATCG CTCTTAAAGGCGTCTGCCGTGATAAGCTCTGTAGTACTCTAGACGATACCATAGGGATATGTAATGAAGGTAAAAAGTGCTGTAGAAGGTGGTGGATTCTGGAACCCTATCCAACCCCGGTCCCAAAAGGTAAGAGCCCTGGTACCGGTGTTATTCCTGGCCA，3×β-防御素130的編碼序列為3個β-防御素130直接串聯組成，由蘇州金維智公司合成并克隆至pUC57載體上，通過RⅠ和Ⅰ兩個酶切位點對其進行雙酶切，獲得目的基因。對pET28a載體使用同樣的內切酶進行雙酶切，回收后與目的基因連接，并采用化學轉化法轉入XL1-blue感受態細胞，隨后從平板中挑取陽性菌落進行培養，抽提質粒，測序驗證。

1.2.2 融合蛋白的表達與優化

IPTG誘導濃度的條件優化：挑取含有pET- 28a-3×β-defensin130載體的大腸桿菌BL21(DE3)單克隆菌落，在含卡那霉素 (120 μg/mL) 的100 mL LB培養基中37 ℃、200 r/min過夜培養 (12 h)。將50 mL過夜培養物接種于1 L培養基中，于37 ℃、200 r/min培養。當600值達到0.6時，將培養溫度降至16 ℃，同時加入不同濃度 (0.05– 1.2 mmol/L) 的IPTG誘導劑，連續培養16 h。隨后，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集菌體進行超聲破碎。以未誘導的含pET28a(+)載體的大腸桿菌BL21 (DE3) 作為蛋白表達的載體對照，進行SDS-PAGE分析。IPTG誘導時間的條件優化：挑取含有pET-28a-3×β-防御素130載體的大腸桿菌BL21(DE3)單克隆菌落，在含卡那霉素(120 μg/mL) 的100 mL LB培養基中37 ℃、200 r/min過夜培養 (12 h)。將50 mL過夜培養物接種于1 L培養基中，于37 ℃、200 r/min培養。當600值達到0.6時，將培養溫度降至16 ℃，同時加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導劑，連續培養，每2 h取一次樣。隨后，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集菌體進行超聲破碎。以未誘導的含pET28a(+)載體的大腸桿菌BL21 (DE3) 作為蛋白表達的載體對照，進行SDS-PAGE分析。

1.2.3 融合蛋白的親和純化

將1 L誘導表達后的菌體重新懸浮于20 mL的裂解緩沖液中 (50 mmol/L Hepes，0.5 mol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L PMSF，10%甘油，20 mmol/L咪唑，4 mmol/L β-巰基乙醇， 1 mg/mL溶菌酶，pH 7.4)，冰上孵育20 min，超聲破碎后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸出上清液，加入預先使用裂解液平衡好的Ni-NTA蛋白純化柱在4 ℃下結合6 h，結合完畢后流出結合液，用3倍柱體積的裂解液漂洗3遍，最后用含500 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，然后進行透析除去咪唑，最后超濾管離心濃縮獲得目的蛋白，使用Brandford法測定蛋白濃度。

1.2.4 SDS-PAGE和Western blotting分析

將定量的蛋白樣品與2×SDS-PAGE上樣緩沖液以1∶1的比例混合，煮沸10 min。在15%的SDS-PAGE凝膠上進行分離，每孔上樣20 μg蛋白，電泳條件為150 V、1.5 h，進行考馬斯亮藍染色或電轉移至0.45 μm的硝酸纖維素膜進行免疫印跡分析。使用5%脫脂奶粉封閉印跡膜1 h，然后用抗His抗體 (1∶2 000) 孵育1 h。將印跡膜用TBST洗滌3次，加入含HRP偶聯的山羊抗兔二抗 (1∶5 000) 的封閉液再孵育1 h。使用TBST洗滌3次之后，使用ECL顯色液進行顯影，掃膜儀拍照[11]。

1.2.5 最小抑菌濃度測定

以PBS作為對照組，使用PBS稀釋3×β-防御素130 (10–120 μg/mL)，96孔板每孔加入20 μL稀釋液。受試細菌培養至濃度為2×105–7×105CFU/mL，每孔100 μL菌懸液加入96孔板。然后37 ℃、220 r/min培養12 h，最后使用酶標儀測定600。所有試驗均獨立重復進行3次[12]。

1.2.6 抑菌圈測定

首先，從平板中挑取受試菌落于含有5 mL LB培養基的15 mL試管，在37 ℃、220 r/min條件下培養。當濃度達到2×105CFU/mL時，取500 μL的細胞液涂布在LB平板上。使用8 mm打孔器打孔，將純化的3×β-防御素130分別在4 ℃、25 ℃、37 ℃、65 ℃、90 ℃下孵育1 h，然后加入孔中，孵育12–24 h，觀察平板抑菌圈大小。測定pH值耐受實驗時，將純化的3×β-防御素130干粉分別使用pH值為2、4、6、8、10的溶液進行溶解，加入平板孔中，孵育12–24 h，觀察平板抑菌圈大小。測定蛋白酶耐受實驗時將純化的3×β-防御素130分別用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶在37 ℃下處理1 h，隨后加入平板孔中，孵育12–24 h，觀察平板抑菌圈大小。所有試驗均獨立重復進行3次[13]。

1.2.7 MTT法

HEK293細胞作為候選細胞系，將不同濃度的3×β-防御素130 (0、20、40、60、80、100、120、140、160 μg/mL) 與HEK293細胞在96孔板中孵育72 h，然后向每孔中加入20 μL甲基噻唑四唑(MTT，5 mg/mL)，在37 ℃下再孵育4 h。在該板上加入二甲基亞砜 (DMSO)，以溶解藍紫色的甲瓚晶體。最后，用酶標儀測量570 nm的吸光度。用標準公式計算細胞存活率(%)=3×β-防御素130 處理的吸光度/對照細胞的吸光度×100%。所有試驗均獨立重復進行3次。

1.2.8 溶血性試驗

將新西蘭白兔全血樣品置于含K2EDTA的離心管中，1 000 r/min離心5 min，除去血漿。用1×PBS洗滌3次，調整紅細胞濃度為4%。將90 μL的紅細胞與10 μL的3×β-防御素130混合，37 ℃再孵育30 min，1 500 r/min離心10 min，測定上清液在540 nm處的吸光值。分別用1×PBS和1%的Triton X-100作為0%和100%溶血對照。

2 結果與分析

2.1 pET28a-3×β-防御素130載體的構建

β-防御素130由171 bp的核苷酸序列編碼，串聯重復序列由3個拷貝的編碼序列組成，將合成的3×β-防御素130編碼序列分別插入到pET28a(+)載體中，RⅠ和Ⅰ位點分別位于5′端和3′端。圖1是N-末端含有6×His標簽的pET28a-3×β-defensin130載體示意圖。

2.2 3×β-防御素130的表達與優化

IPTG誘導劑優化結果如圖2A所示，在誘導細胞中按預期表達了25 kDa蛋白，根據條帶灰度，不同濃度的IPTG誘導的表達水平沒有差異(圖2A)。為了優化誘導時間，自IPTG加入到0.5 mmol/L的最終濃度后，每2 h收集培養細胞。將8 h 誘導細胞的表達水平設為100%時，10、12、14、16 h內3×β-防御素130的表達量分別為330%、328%、327%和332% (圖2B)。以上結果表明，在16 ℃條件下表達3×β-防御素130的最佳培養條件是0.5 mmol/L IPTG誘導表達12 h。

圖1 載體元件示意圖

圖2 3×β-防御素130的表達及培養條件優化

2.3 3×β-防御素130的純化及Western blotting分析

為了確定重組蛋白的水溶性，我們用最佳培養條件培養細胞。如圖3A所示，重組3×β-防御素130在大腸桿菌中以可溶性形式表達，Western blotting證實了3×β-防御素130的特異性 (圖3B)。親和純化后的蛋白使用SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色以及Western blotting分析，得到25 kDa 3×β-防御素130 (圖3C–D)。

2.4 3×β-防御素130抗菌譜的測定

用最小抑菌濃度法測定3×β-防御素130的抗菌譜，結果見表1。重組3×β-防御素130對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有抑菌活性，對金黃色葡萄球菌抑菌濃度最低 (ATCC 25923) 為45 μg/mL，對枯草芽孢桿菌 (AHU 1035) 和單增李斯特菌 (ATCC 21633) 的最小抑菌濃度分別為50 μg/mL和80 μg/mL。對革蘭氏陰性菌大腸桿菌O157 (ATCC 35150)、腸炎桿菌 (ATCC 10467) 和綠膿桿菌 (ATCC 27853) 的最小抑菌濃度分別為60、55、50 μg/mL。

圖3 3×β-防御素130的純化及Western blotting分析

表1 純化后的重組3×β-防御素130抗菌譜

2.5 3×β-防御素130對溫度、pH值和蛋白酶消化的耐受性

選用金黃色葡萄球菌 (ATCC 25923) (40 μg/mL) 對3×β-防御素130進行抑菌耐受活性分析。3×β-防御素130經不同溫度(4 ℃、25 ℃、37 ℃、65 ℃、90 ℃) 處理后，抑菌活性無明顯變化 (圖4A)。如圖4B所示，pH值并未影響3×β-防御素130的生物活性，經不同pH值 (2、4、6、8、10) 處理的3×β-防御素130，其抑菌效果沒有差異。為了分析蛋白酶對3×β-防御素130生物活性的影響，采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶處理3×β-防御素130。結果表明，3×β-防御素130對蛋白酶消化具有一定耐受性，其抑菌作用不受影響 (圖4C)。

圖4 3×β-防御素130對溫度、pH值和蛋白酶消化的耐受性分析

2.6 3×β-防御素130的細胞毒性及溶血性

與對照組相比，重組3×β-防御素130并未改變HEK293細胞的存活率，表明3×β-防御素130在20–120 μg/mL濃度下沒有細胞毒性 (圖5A)。此外，純化的3×β-防御素130加入0–120 μg/mL重組3×β-防御素130后，對兔紅細胞無溶血性 (圖5B)。當蛋白濃度分別為160 μg/mL和200 μg/mL時，溶血活性分別小于0.8%和1.6%，表明3×β-防御素130幾乎不具有溶血性。

3 討論

將3×β-防御素130構建至表達載體pET28a上，其中T7作為啟動子啟動轉錄，T7-Ter作為終止子終止轉錄。結果表明，3×β-防御素130在中的分子量為25 kDa。從哺乳動物細胞中提取β-防御素130是一種高成本、低效率的生產方法。鑒于其制備效率低下，我們采用原核生物大腸桿菌作為細胞工廠用于大規模生產重組β-防御素130。重組3×β-防御素130在大腸桿菌中成功表達且為可溶性蛋白，并且我們優化了IPTG濃度和誘導時間等培養條件。許多利用大腸桿菌重組表達的抗菌肽，如雜合AL32-P113[14]和HG31-P-113[15]，通過優化培養條件，均成功表達并且提高了產量和抗菌活性。這些結果表明大腸桿菌可能是制備3×β-防御素130的合適宿主。大腸桿菌的遺傳背景清楚、生長速度快、培養成本低，蛋白表達效率同畢赤酵母和哺乳動物細胞相比可以高出好幾倍，同時所獲得大多數蛋白的活性較高，穩定性也較好。從大腸桿菌表達的3×β-防御素130抗菌活性測試中可以看出，其對革蘭氏陰性和陽性菌均表現出較強的抗菌活性和穩定性。這些進一步證明抗菌肽的串聯表達也是提高抗菌肽活性的一種有效策略。

為了進一步探討3×β-防御素130在不同環境條件下的應用，對3×β-防御素130進行了極端pH變化、熱處理和蛋白酶消化試驗。結果表明，在pH變化和熱處理的不同培養條件下，3×β-防御素130的抗菌活性不受影響。此外，本實驗研究了3×β-防御素130對木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶的抗性。結果表明，3×β-防御素130具有作為商業抗生素替代品和食品防腐劑的潛力。溶血試驗表明，當濃度低于120 μg/mL時，3×β-防御素130對兔紅細胞無溶血活性，當濃度分別為160 μg/mL和200 μg/mL時，3×β-防御素130對兔紅細胞的溶血活性分別小于0.8%和1.6%，表明3×β-防御素130對兔紅細胞無溶血活性。相比之下，當蛋白濃度為100 μg/mL時[14]，有報道的混合肽L31-P113和AL32-P113的溶血活性超過1.8%。當蛋白濃度為128 μg/mL時[16]，LH28的溶血性為35%。這些結果表明，與其他抗菌肽相比，3×β-防御素130具有較低的溶血活性。此外，大腸桿菌表達的3×β-防御素130對HEK293細胞沒有毒性，因此3×β-防御素130是一種安全的抗生素替代品。

在本實驗中，使用6×His作為蛋白標簽進行抗菌肽的重組表達，分子量較小，對蛋白結構和功能影響不大，便于純化，是目前應用最多的標簽，且已有大量抗菌肽以6×His作為標簽在大腸桿菌和畢赤酵母中進行表達且不影響生物活性。另外，利用大腸桿菌進行蛋白表達有可能因蛋白錯誤折疊導致以水不溶的包涵體形式存在于細胞中，越來越多的融合標簽被開發應用于蛋白的促溶，如MBP和GST標簽等。本實驗中的串聯抗菌肽未出現包涵體，可能是由于抗菌肽結構相對簡單容易折疊形成水溶性蛋白。

綜上所述，β-防御素130在大腸桿菌中作為一種可溶性蛋白成功表達，并對常見的革蘭氏陽性菌和陰性菌具有較強的抗菌活性，且其抗菌活性不受溫度、pH值和蛋白酶消化的影響。此外，大腸桿菌中表達的3×β-防御素130對HEK293細胞沒有顯示毒性，并且顯示出相對低的溶血活性。

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Tandem expression, purification and biological activity of recombinant multimeric β-defensin130 in

Yanjun Lin1,2, and Bin Dong1

1 Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta, College of Biological and Environmental Engineering, Binzhou University, Binzhou 256603, Shandong, China 2 College of Art and Design, Binzhou University, Binzhou 256603, Shandong, China

To improve and broaden the antimicrobial activity of β-defensin130, 3 copies of β-defensin130 encoding sequences were synthesized and cloned into pET28a (+) expression vector, and expressed inBL21 (DE3) as a 25 kDa soluble protein. The affinity purified 3×β-defensin 130 displayed antimicrobial activity against not onlyGram-positive strains including(ATCC 25923) (45 μg/mL) and(ATCC 221633) (80 μg/mL) but also Gram-negative strains. Furthermore, the antimicrobial activity of β-defensin130 was not affected by temperature, pH and proteinase digestion. In addition,-derived 3×β-defensin130 was not toxic to HEK 293 cells and showed a relatively low hemolytic activity against rabbit erythrocytes. Our study proves 3×β-defensin130 expressed inis stable, non-cytotoxic and low-hemolytic active with great potential as alternative antibiotics.

defensin, antimicrobial peptide, prokaryotic expression, protein purification, antimicrobial activity

November 28, 2018;

April 18, 2019

Natural Science Foundation of Shandong Province (No. ZR2018PC010), the Doctor Foundation of Binzhou University (No. 2018Y09), Natural Science Program of Binzhou University (No. BZXYG1811).

Bin Dong. Tel: +86-543-3190042; E-mail:dongbin@bzu.edu.cn

山東省自然科學基金 (No. ZR2018PC010)，濱州學院博士科研啟動費項目 (No. 2018Y09)，濱州學院科研項目 (No. BZXYG1811)資助。

10.13345/j.cjb.180492

藺艷君, 董彬. β-防御素130在大腸桿菌中的串聯表達、純化及生物活性分析. 生物工程學報, 2019, 35(6): 1088–1096.

Lin YJ, Dong B. Tandem expression, purification and biological activity of recombinant multimeric β-defensin130 in. Chin J Biotech, 2019, 35(6): 1088–1096.

(本文責編 郝麗芳)