HPLC法測定五味子合劑中五味子醇甲含量的研究

1.柳州市中醫醫院，廣西 柳州 545001，2.玉林市食品藥品檢驗檢測中心，廣西 玉林 537001

五味子合劑是柳州市中醫醫院的一代老中醫的驗方，由五味子和黃芪等中藥提煉組成。為棕黃色澄明液體，味甜、微酸，具有補氣鎮靜的功效，常用于神經衰弱、失眠、健忘、營養不良等疾病。其中，五味子在該配方中位列君藥，起主導作用。五味子為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實，習稱北五味子，具有斂肺止咳、固腎納氣；滋養肝腎、強健筋骨；固精止遺、澀腸止瀉；生津止渴、益氣斂汗；滋腎寧心，調解酒毒的臨床功效[1-2]。五味子入藥始載于《神農本草經》，列為上品，后在《圖經本草》和《名醫別錄》均有記載和考證，具有極高的藥用價值?，F代研究表明[3-4]五味子具有增加機體免疫力，清除氧自由基、抑制脂質過氧化，誘導腫瘤細胞凋亡，升高白細胞等藥理作用。五味子中所含的木脂素類成分是其主要的有效活性成分，其中以含量較高的五味子醇甲為代表[5-6]，有研究表明[7]五味子醇甲對急性炎癥小鼠模型和免疫抑制小鼠模型增強效果顯著。鑒于五味子合劑療效確切、應用廣泛，口碑較好，而原質量標準中僅有理化鑒別，無含量測定項，且未見報道以其有效成分五味子醇甲的含量測定為定量控制指標，對其內在質量控制性不足，因此為了提高五味子合劑的質量標準，本實驗對五味子合劑中五味子醇甲的含量進行初步研究，建立了五味子合劑中五味子醇甲的HPLC含量測定方法，為評價五味子合劑的質量提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 U3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；Synergy超純水機(美國Millipore公司)；XS-205Du電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。

1.2 試藥 五味子合劑(批號：20170121，柳州中醫院制劑室制備)。五味子醇甲對照品(批號：110857-200304，中國藥品生物制品檢定所)；甲醇(色譜純，批號：UN1230，默克股份兩合公司)、乙腈(色譜純，批號：UN1648，默克股份兩合公司)，冰醋酸(優級純，批號：10000218，國藥集團化學試劑有限公司)，乙酸乙酯(色譜純，批號UN1173，默克股份兩合公司)，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱：Ag-ilent EtlipseXDB-C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流動相：乙腈-0.5%冰醋酸溶液(60∶40)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：250 nm；進樣量為10 μL。在此條件下，理論塔板數以五味子醇甲峰計算應不低于5000。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取五味子醇甲15.97 mg，置25 mL量瓶中，加適量甲醇超聲使溶解，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。(濃度為0.6388 mg/mL)。

2.3 供試品溶液制備 精密量取五味子合劑10 mL，用乙酸乙酯萃取兩次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣用甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中并定容，過濾，取續濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液制備 按處方比例分別稱取除五味子以外的其余藥味，按制備工藝制備陰性樣品，按“2.3供試品制備方法”制備陰性對照溶液。

2.5 干擾實驗 分別精密吸取上述五味子醇甲對照品溶液、五味子合劑供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，在上述色譜條件下，供試品中五味子醇甲與對照品色譜峰保留時間一致，并與相鄰色譜峰分離度大于1.5，陰性無干擾。色譜圖如圖1所示。

2.6 線性關系考察 分別精密量取上述五味子醇甲對照品溶液(濃度為0.6388 mg/mL)0.2、0.5、1、2、5 mL定容到10 mL，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，測定五味子醇甲的峰面積，以五味子醇甲的濃度(x)為橫坐標，其峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為y=0.426x-0.075，r=0.9993。結果表明五味子醇甲進樣量在0.128～3.194 μg之間與峰面積值呈現良好的線性關系。

2.7 精密度試驗 精密吸取五味子醇甲對照品溶液(濃度為0.6388 mg·mL-1)10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄五味子醇甲圖譜及峰面積，結果五味子醇甲平均峰面積值RSD為0.4%。表明該液相色譜儀的精密度良好。

2.8 穩定性試驗 精密量取五味子合劑(批號為20170121)10 mL，按“2.3供試品制備方法”制備，按“2.1”項下色譜條件，分別于1、2、4、6、12、24 h進樣，記錄圖譜及數據并計算其含量，考察五味子合劑供試品溶液的穩定性。結果顯示：在24 h內五味子醇甲平均含量RSD為1.6%。表明五味子合劑供試品溶液在24 h內具有良好的穩定性。

2.9 重復性試驗 取同一批五味子合劑6份(批號為20170121)，分別精密量取10 mL，按“2.3供試品制備方法”制備，按2.1項下色譜條件測定五味子醇甲峰面積并計算其含量，考察方法的重復性。結果五味子醇甲平均含量為0.058 mg/mL，RSD為1.8%。表明該方法的重復性良好。

2.10 加樣回收試驗 取已知含量(含量為0.058 mg/mL)的五味子合劑6份，每份精密量取5 mL，置分液漏斗中，再加入濃度為0.6388 mg/mL的五味子醇甲對照品溶液0.5 mL，自“用乙酸乙酯萃取兩次”起，按“2.3供試品溶液制備”方法處理，按“2.1”項下色譜條件測定五味子醇甲峰面積并計算回收率，平均回收率為97.70%，RSD為1.6%，表明該方法系統誤差較小。結果見表1。

表1 供試品五味子醇甲回收率試驗結果 (n=6)

2.11 樣品含量測定 分別取6個不同批次的五味子合劑各一份，每份精密量取10 mL，按“2.3供試品制備方法”制備，按“2.1”項下色譜條件測定五味子醇甲峰面積并計算其含量。結果見表2。

表2 五味子合劑樣品測定結果

3 討論

五味子是五味子合劑中的君藥，五味子中有效成分的含量直接影響到藥品的療效。2015年版《中國藥典》一部將五味子醇甲作為評價五味子質量的指標成分，規定其含有量不低于0.4%[1]。藥典中含五味子的中成藥中也多采用五味子醇甲含量測定來作為質量控制指標[8-9]。故本實驗以五味子醇甲為質量控制指標[10]。在對本品五味子醇甲的分離試驗中，考察了甲醇-水為流動相進行測定，目標峰與雜質峰分離不太理想，故改用乙腈-0.5%冰醋酸溶液(60∶40)為流動相，目標峰五味子醇甲與雜質峰分離效果比較理想，且與相鄰色譜峰分離度大于1.5。在200～400 nm波長范圍內進行掃描，結果在218 nm和250 nm波長處有最大吸收，故以250 nm為檢測波長，與2015版《中國藥典》一部規定一致。該法操作簡便快捷，重復性及穩定性良好，結果準確可靠，可作為控制五味子合劑質量的方法。