ELISA與NAT檢測在血液HBV篩查中的關系研究

錢江 蔡雋 華重千 牛鴻婧

全球每年有近百萬人因輸入不健康血液或血液制品而感染病毒性肝炎等輸血傳播性疾病，已約有4億人感染了慢性乙型肝炎，HBV感染已成為世界性的公共衛生問題[1]。國人HBsAg陽性率約為9.8%，HBV感染率約為59.3%，超過1.3億人為HBV攜帶者，約8億多人感染了HBV[2]。人體感染HBV后容易引發肝炎、肝硬化，甚至發展成肝癌，嚴重威脅生命安全。為降低輸血傳播HBV的發生率，采供血機構常采用2種不同廠家生產的ELISA試劑對獻血者血液標本進行HBsAg檢測。但由于HBV檢測窗口期長、臨床變異株多以及免疫沉默現象等的局限，ELISA檢測仍然存在一定程度的漏檢。病毒核酸擴增（NAT）技術基于直接檢測HBV核酸的原理，在人體感染HBV后數天內就能檢出血液標本中極其微量的病毒DNA，可大幅縮短病毒檢測窗口期[3-4]，降低HBV漏檢的發生率?；诖?，本研究通過分析ELISA與NAT檢測血液HBV的符合率，探討這2種方法在血液HBV篩查中的關系，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 血液標本 選取金華市中心血站2017年6月至2018年6月經采血現場快速初篩合格的獻血者血液標本共59 483份，所有獻血者均符合《獻血者健康檢查要求》的規定。按照《血站技術操作規程2015》的要求，在采血結束后立即依次用3支采血管留取相應血液標本，第1支為帶分離膠的促凝管（EDTA－K2促凝、5ml）用于血清學檢測；第2支為帶分離膠的的真空采血管（EDTA－K2抗凝、8ml）用于核酸檢測；第3支為無分離膠的抗凝管（EDTA-K2抗凝、5ml）用于血型、ALT的檢測。血液采集后4h內離心分離紅細胞和血漿，置于2～8℃環境保存，72h內完成血液核酸檢測。

1.2 試劑 HBsAg ELISA檢測國產試劑（廈門新創，批號：2107015103、2017045109等），進口試劑（法國伯樂，批號：6M0223、7A0226等）。HBV DNA NAT檢測試劑（美國羅氏 Cobas TaqScreen MPX 2.0 test，批號：215559、235646等）。

1.3 儀器設備 Xantus150全自動酶免加樣儀（深圳愛康公司），Fame24/20全自動酶免分析儀（瑞士HAMILTON公司），Microlab Star全自動混樣儀（瑞士HAMILTON公司），COBAS@AmpliPrep全自動核酸提取純化儀（美國羅氏公司），COBAS@TaqMan全自動醫用PCR分析系統（美國羅氏公司）。

1.4 檢測方法

1.4.1 ELISA檢測 采用Xantus150全自動酶免加樣儀將血液標本分配至各檢測項目的微板上，用Fame24/20全自動酶免分析儀對其進行加酶、孵育、洗板、顯色，用血站實驗室信息管理系統判讀結果。2種ELISA試劑檢測HBsAg結果均呈反應性則判為雙試劑陽性；2種試劑檢測結果均呈無反應性則判為陰性；單試劑初篩結果呈反應性，雙孔復檢后結果呈反應性則判為單試劑陽性，否則為陰性。ELISA檢測陽性包括ELISA檢測雙試劑陽性與單試劑陽性。

1.4.2 NAT檢測 先采用Microlab Star全自動混樣儀對ELISA檢測陰性和單試劑陽性的標本進行6人份HBV DNA的混樣檢測，再用COBAS@AmpliPrep全自動核酸提取純化儀對混樣樣本進行核酸的提取和純化，最后用COBAS@TaqMan全自動醫用PCR分析系統檢測HBV DNA擴增后的靶序列，在PDM服務器中自動判讀結果?；鞓訖z測結果呈無反應性則判定為6個標本HBV DNA檢測陰性?；鞓訖z測結果呈反應性則進行拆分檢測，拆分檢測呈無反應性則判定HBV DNA檢測陰性；若拆分檢測結果呈反應性則判定該標本HBV DNA檢測陽性。ELISA檢測雙試劑陽性標本直接進行單人份HBV DNA檢測，檢測結果呈無反應性則判定HBV DNA檢測陰性，檢測結果呈反應性則判定HBV DNA檢測陽性。

1.5 觀察指標 （1）ELISA與NAT檢測血液HBV的結果；（2）ELISA 與 NAT 檢測血液 HBV 的符合率；（3）ELISA與NAT檢測血液HBV的標本吸光度與臨界值的比值（S/CO值）分布情況，S/CO值反映出NAT檢測對不同濃度HBV DNA的檢測能力。

2 結果

2.1 ELISA與NAT檢測血液HBV結果59 483例血液標本中ELISA檢測雙試劑陽性NAT檢測陽性的標本25例，ELISA檢測單試劑陽性NAT檢測陽性的標本30例，ELISA檢測陰性NAT檢測陽性120例，ELISA檢測雙試劑陽性NAT檢測陰性的標本6例，ELISA檢測單試劑陽性NAT檢測陰性的標本38例，ELISA與NAT檢測陰性的標本59 264例，見表1。

表1 59483例血液標本ELISA與NAT檢測HBV結果[例（%）]

2.2 ELISA與NAT檢測血液HBV的符合率 ELISA檢測雙試劑陽性標本31例，其中NAT檢測陽性25例，兩者符合率為80.6%；ELISA檢測單試劑陽性68例，其中NAT檢測陽性30例，兩者符合率為44.1%；ELISA檢測陽性共99例，其中NAT檢測陽性共55例，ELISA與NAT檢測血液HBV的符合率為55.5%。

2.3 ELISA與NAT檢測血液HBV的S/CO值分布情況 ELISA檢測雙試劑陽性NAT檢測陽性標本共25例，其中S/CO值＜2為1例，2≤S/CO值＜5為1例，S/CO值≥5為23例；ELISA檢測單試劑陽性NAT檢測陽性標本共30例，其中S/CO值＜2為14例，2≤S/CO值＜5為11例，S/CO值≥5為5例；ELISA檢測單試劑陽性NAT檢測陰性標本共38例，其中S/CO值＜2為24例，2≤S/CO值＜5為11例，S/CO值≥5為3例；見表2。

表2 ELISA與NAT檢測血液HBV的S/CO值分布情況[例（%）]

3 討論

輸血作為一種重要的治療方法已廣泛應用于臨床，但輸血也存在傳播各類病毒的風險，對患者造成嚴重的危害，因此輸血安全問題已成為全球關注的焦點。隨著ELISA檢測試劑靈敏度、特異度的大幅提升，輸血傳播性疾病的發生風險已大幅降低，但由于存在檢測窗口期，ELISA檢測無法從根本上杜絕其發生。據統計，超過90%HBV、HIV和75%以上的HCV的輸血傳播感染均來源于病毒窗口期，NAT檢測可直接檢測病毒微量核酸，將窗口期分別從原來的50、72、22d縮短至25、59、11d[5]，是一種理想的檢測技術。

本研究通過對金華市中心血站59 483例血清標本進行ELISA與NAT檢測HBV，檢出ELISA檢測陽性NAT檢測陽性標本55例，ELISA檢測陽性NAT檢測陰性標本44例，因未進行追蹤確認，無法判斷是NAT漏檢或是ELISA檢測假陽性，也無法對其真實的血清學狀態進行判斷。分析造成ELISA檢測陽性NAT檢測陰性的原因，可能是由于獻血者體內攜帶HBV，因處于血清學轉換期，HBV載量過低，NAT無法直接檢測到病毒DNA，但可以通過ELISA檢測到HBsAg，故ELISA檢測對處于血清轉換期的HBV攜帶者具有較好的排查作用。ELISA檢測陰性NAT檢測陽性標本高達120例，通過NAT檢測彌補ELISA不能直接檢測病毒核酸的方法學缺陷，可有效避免攜帶HBV的血液制品用于臨床。有研究報道稱，若采用國產ELISA試劑與NAT聯檢，獻血人群中HBV漏檢率約為16/10萬；若采用進口ELISA試劑與NAT聯檢，獻血人群中HBV漏檢率約為1.6/10萬[6]。國產試劑的ELISA漏檢率比進口試劑大10倍，進口ELISA試劑的檢測靈敏度明顯優于國產試劑，因此血站檢驗科可以選擇或保持進口ELISA試劑與NAT聯檢的方式對獻血者血清標本進行血液HBV篩查，以提高準確度。

本研究ELISA檢測雙試劑陽性NAT檢測陽性25例，ELISA檢測雙試劑陽性NAT檢測陰性6例，兩者符合率為80.6%，這與張瓊等[7]報道相似，NAT有部分漏檢的情況也基本與國內外報道相符[8-11]。ELISA檢測單試劑陽性68例，其中NAT檢測陽性30例，兩者符合率僅為44.1%，明顯低于ELISA檢測雙試劑陽性NAT陽性的符合率。由于ELISA檢測各環節中的不可控因素較多，單試劑檢測陽性的標本中會存在高比例的假陽性[12]，是導致符合率較低的原因之一。觀察S/CO值分布情況可知，ELISA檢測雙試劑陽性NAT檢測陽性標本中S/CO值≥5比例為92.0%；而ELISA檢測單試劑陽性NAT檢測陽性標本中S/CO值≥5比例僅為16.6%，NAT對不同載量乙肝病毒檢測能力的差異造成了兩者符合率的不同。

NAT檢測是以HBV DNA為檢測對象，可以大大縮短抗體檢測窗口期。目前，很多未開展NAT檢測的血站仍然采用ELISA檢測方法對HBsAg進行檢測，由于HBV病毒載量低，這樣做容易使處于血清轉換期的HBV漏檢，NAT檢測技術正好彌補了這一缺陷[13-14]，可降低隱匿性乙型肝炎的發生率。在HBV疫苗接種、抗病毒藥物使用、抗病毒治療的過程中，由于病毒變異，HBsAg的合成降低、結構改變，病毒復制受限，均會造成HBV在ELISA檢測中漏檢，而NAT檢測則不受此類因素的制約。

綜上所述，ELISA與NAT檢測在血液HBV篩查中各具優勢、各有利弊，2種檢測方法不能相互取代，只能互為補充。本血站現行的ELISA與NAT相結合的檢測模式是目前采供血機構降低HBV輸血傳播發生風險比較理想的一種檢測模式，對保障血液安全起著重要的作用。