METTL3在結直腸癌組織中的表達及其臨床意義

黃忠炎 王劍飛 孫金杰 田洋洋

結直腸癌是目前常見的惡性腫瘤，同時也是高致死率的惡性疾病之一，嚴重威脅國民健康。盡管結直腸癌診治技術近年來迅速發展，化療方案不斷更新，但結直腸癌的長期生存情況仍然較差，研究結直腸癌診斷、預后評價以及與其臨床特征相關的分子標志物仍具有重大意義[1-2]。

N6-甲基腺苷（M6A）是mRNAs和lncRNAs最常見的修飾方式。M6A修飾主要發生在RACH序列中的腺嘌呤上（R=G或A；H=A、C或U）并參與了RNA的穩定性、定位、剪接和翻譯的調節[3-5]。M6A可影響多種生物學過程，包括發育、免疫、DNA損傷反應、腫瘤形成和轉移、干細胞更新、生物節律、細胞分化及細胞周期等[6-7]。M6A的修飾是通過甲基轉移酶樣蛋白3（METTL3）、甲基轉移酶樣 14（METTL14）和 Wilms腫瘤相關蛋白（WTAP）實現的[8-9]。目前證實METTL3是促進腫瘤進展的重要因素[10]，但對結直腸癌METTL3是否可作為結局預判的指標報道不多，故我們收集67例結直腸癌患者的病理組織標本進行研究，觀察METTL3 mRNA和蛋白在結直腸癌中的表達情況，探討其與患者生存時間及臨床病理指標之間的關系，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2013年4月至2017年12月在本院接受結直腸癌根治術的67例患者作為研究對象，其中男性 29例，女 38例，年齡 18～70（59.03±12.84）歲；瘤徑＜5cm者35例，＞5cm者32例；腫瘤組織分化好者19例，分化差者48例；存在遠處轉移者23例，未轉移者44例；存在淋巴結轉移者39例，未轉移者28例；腫瘤侵襲深度達T1、T2水平共18例，T3、T4水平共49例。收集術中切除的結直腸癌組織及配對癌旁正常組織標本，以及24例肝轉移組織標本。所有患者術前未接受過放化療，組織標本的使用取得患者或家屬的知情同意。本研究經本院倫理委員會審查通過。本研究所采用的RT-PCR及免疫組化技術檢測均委托杭州億徠生物科技有限公司進行。

1.2 方法

1.2.1 METTL3 mRNA 檢測采用RT-PCR技術。原位腫瘤組織、正常組織及肝轉移組織通過液氮碾碎后經Trizol法提取RNA。通過TAKARA逆轉錄試劑盒（日本寶日醫生物科技公司產品）合成cDNA，再通過一步法SYBR熒光定量試劑盒（北京全式金生物科技公司產品）于PCR儀（美國羅氏公司產品）進行定量檢測和分析。所有定量結果與GADPH相比較。所有引物購自于杭州億徠生物科技有限公司。引物如下：METTL3 forward，50-TTGTCTCCAACCTTCCGTAGT-3′;METTL3 reverse，50-CCAGATCAGAGAGGTGGTGTAG-3′；GAPDHforward，50-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′；GAPDHreverse，50-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。

1.2.2 METTL3蛋白 檢測采用免疫組化技術。對獲得的組織進行石蠟包埋，同時切成4μm每張行免疫組化染色，應用En Vision法通過自動免疫組化染色機器（Dako，丹麥）進行染色，病理結果由2位高年資病理科醫師進行判定。鼠抗人METTL3蛋白單克隆抗體為美國Abcam公司產品，En Vsion免疫組化試劑盒為丹麥Dako公司產品。METTL3的染色定位在核上，以細胞核被染成棕黃色者為陽性細胞。根據陽性細胞百分比評分：0%為0分；1%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。染色深度評分：0分為沒有染色；1分為弱染色；2分為中度染色；3分為強染色。

1.3 統計學處理 采用SPSS17統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson法；采用ROC曲線法計算METTL3 mRNA相對表達量的截斷值。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，計算METTL3 mRNA高表達與低表達患者的生存時間，并采用log-rank法比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 METTL3 mRNA在正常組織、腫瘤組織及肝轉移組織中的表達情況 見圖1。

圖1 METTL3 mRNA在腫瘤組織及肝轉移組織中的表達情況（*P＜0.05）

由圖1可見，與正常組織比較，METTL3 mRNA在腫瘤組織及肝轉移組織中存在高表達（P＜0.05）。結直腸腫瘤Ⅰ/Ⅱ期患者中METTL3 mRNA的表達也是低于Ⅲ/Ⅳ期患者（P＞0.05）。通過ROC曲線計算得METTL3 mRNA相對表達量的截斷值為2.85。METTL3 mRNA相對表達量高于2.85視為高表達，反之視為低表達。

2.2 METTL3蛋白在正常組織、腫瘤組織及及淋巴結轉移組織中的表達情況 見圖2。

由圖2可見，METTL3蛋白在腫瘤組織中存在明顯的中強染色，在正常組織中存在弱染色，且陽性細胞比例遠低于腫瘤組織中。

2.3 METTL3 mRNA的表達與臨床病理因素的相關性見表1。

由表1可見，METTL3 mRNA的表達與淋巴結轉移存在顯著相關性（P＜0.01），但是其與年齡、性別、腫瘤大小、組織分化程度、遠處轉移及侵襲深度無明顯的相關性。

圖2 METTL3蛋白在正常組織、腫瘤組織及及淋巴結轉移組織中的表達情況（免疫組化染色，×400）

表1 METTL3mRNA的表達與臨床病理因素的相關性[例（%）]

2.4 METTL3 mRNA的表達與結直腸癌患者生存預后的關系 見圖3。

由圖3可見，METTL3 mRNA高表達與低表達患者的中位生存時間分別為23個月與43個月，在隨訪的4年時間中METTL3 mRNA低表達患者的生存率為41.2%，明顯高于METTL3 mRNA高表達者的24.2%，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖3METTL3mRNA高表達與低表達患者生存曲線

3 討論

METTL3作為mRNA甲基轉移酶，參與mRNA的生成和剪切調控進而促使癌基因的翻譯介導了腫瘤進展，并且這種化學修飾是可逆的，廣泛存在于真核生物體內[4]。已有的研究證實METTL3在人肝細胞癌（HCC）中表達上調并預測不良預后，通過實驗證實敲除METTL3可在體外抑制肝癌細胞增殖和遷移，同時在體內抑制肝癌成瘤性和肺轉移[11]。然而，在另一項研究中，METTL3被認為是腎癌的抑癌基因，抑制腫瘤的增殖、遷移和細胞周期[12]，這些結果表明，METTL3可能在不同分化腫瘤中起相反的作用，這可能是由于腫瘤微環境的復雜性和腫瘤高度異質性所致。同時這也與METLL3參與腫瘤的作用機制密不可分。METTL3在腫瘤中的作用機制可分為兩種模式：M6A依賴性和M6A非依賴性。例如，在肝癌中敲除METTL3可以減少M6A甲基化介導的SOC2降解，從而增強SOC2的表達，從而抑制肝癌的進展[11]。相反的，在乳腺癌中METTL3通過M6A修飾增強HBXIP的表達，從而進一步促進乳腺癌的進展[13]。然后METTL3在結直腸癌中的作用機制仍不明顯，需要進一步探索。

本研究著眼于METTL3 mRNA在結直腸癌中的差異表達出發，探索其在結直腸癌中作為癌基因的作用，以及其與結直腸癌臨床病理之間的關系。本研究不僅證實了METTL3 mRNA及蛋白在結直腸癌標本中高表達，高表達的患者生存時間較低表達患者短，同時本研究探索出METTL3 mRNA在Cut-off值，為后續的臨床研究提供方向。本研究的局限是結果建立在67例樣本之上，需要更大的樣本量來支撐。非常有趣的是，METTL3 mRNA和蛋白的表達在本研究中與淋巴結轉移存在顯著性關系，然而與遠處轉移未存在明顯關系，這可能提示METTL3的作用地位集中在疾病進展期間。這也需要大量的后續研究來證實。

綜上所述，METTL3 mRNA和蛋白在結直腸癌中高表達，與結直腸癌的淋巴結轉移存在密切關系。故而，METTL3可作為預測結腸癌分化水平和轉移的重要指標，為以后治療及藥物研發提供了重要依據。關于METTL3在結直腸癌的發生與發展中的調控作用及其分子機制有待進一步研究。