結(jié)直腸癌HOXA11基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的研究

潘烽平 陳一鵬 李彥 張明明

結(jié)直腸癌是全球范圍內(nèi)高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤之一[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制中具有十分重要的作用，其中抑癌基因甲基化是近年來腫瘤表觀遺傳研究的熱點(diǎn)[3]。HOXA11是一個(gè)受表觀遺傳調(diào)控而表達(dá)丟失的基因，異常甲基化導(dǎo)致HOXA11基因表達(dá)下調(diào)，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。研究證實(shí)，在卵巢癌中HOXA11基因啟動(dòng)子CpG島異常甲基化是其不良預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4]。在惡性膠質(zhì)瘤中，HOXA11的異常低表達(dá)與放化療抵抗密切相關(guān)并且影響患者的生存預(yù)后[5]。然而，HOXA11在結(jié)直腸癌中是否存在異常甲基化，HOXA11的異常甲基化是否參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為目前尚未見于研究報(bào)道。本研究以結(jié)直腸癌為研究對象，探討HOXA11在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平以及甲基化程度，以及HOXA11啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化與患者臨床病理特征間的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本 89對結(jié)直腸癌組織及配對的正常腸黏膜組織標(biāo)本取自于2016年8月至2018年10月在嘉興市第一醫(yī)院（55例）和浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科（34例）接受結(jié)直腸癌根治術(shù)的患者。所有患者術(shù)前均未接受放化療，結(jié)直腸癌組織及配對的正常腸黏膜組織均經(jīng)過病理學(xué)檢查證實(shí)。此外，組織標(biāo)本的使用均獲得患者本人或其家屬的同意，并簽署書面同意書。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 本研究選用的6種結(jié)直腸癌細(xì)胞系（HT29、SW480、HCT116、SW620、LoVo 和 SW1116）均購予上海科學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞采用含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 主要試劑和儀器 CpGenome Universal DNA Modification kit、5-Aza-dC均購于美國Sigma-aldrich公司（批號：S7822、A3656）；Trizol試劑購于美國 Invitrogen公司（批號：15596018）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為日本TaKaRa公司產(chǎn)品（批號：RR047A）；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購于日本Toyobo公司（批號：QPK-201）。ABI 7900測序儀購于美國ABI公司。

1.4 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylation-specific PCR，MSP）檢測 HOXA11甲基化狀態(tài)采用酚-氯仿法抽提100mg結(jié)直腸癌和配對正常腸黏膜組織標(biāo)本中的DNA，并以 CpGenome Universal DNA Modification kit試劑盒修飾DNA。甲基化引物（HOXA11-M）和非甲基化引物（HOXA11-U）分別用于擴(kuò)增HOXA11基因5'CpG島甲基化和非甲基化的等位基因，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。HOXA11-U引物序列為：5′-TGTGTGTGAAGTGATTTTTAGAGAGTAT-3′（正 義鏈），5′-AACAATCTCTATACACAAACTCCTCCA-3′（反義鏈）；HOXA11-M 引物序列為：5′-TGCGCGAAGTGATTTTTAGAGAGTAC-3′（正 義 鏈），5′-CAATCTCTATACACGAACTCCTCCG-3′（反義鏈）。MSP反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性 5min，95℃變性 30s，63℃退火 30s，72℃延伸 45s，共 35個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸 5min，4℃終止反應(yīng)。最后將反應(yīng)產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳凝膠呈像系統(tǒng)照相并分析結(jié)果。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測 HOXA11 mRNA表達(dá)水平將6種結(jié)直腸癌細(xì)胞系細(xì)胞置于5-Aza-dC終濃度為20μmol/L的培養(yǎng)液中培養(yǎng)96h，行去甲基化處理。處理前后分別收集細(xì)胞，采用Trizol試劑抽提各組細(xì)胞和正常腸黏膜組織中的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作流程反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，HOXA11上游引物：5'-GCAGCAGAGGAGAAAGAGGG-3′，下游引物：5'-GTGGATTTGCTGAGTAGTACTG；GAPDH 上游引物：5''-CCCATCACCATCTTCCAGGAG-3′，下游引物：5'-CTTCTCCATGGTGGTGAAGACG-3′。采用 ABI 7900測序儀進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性1min，95℃反應(yīng) 10s，59℃反應(yīng) 30s，共 50 個(gè)循環(huán)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)3次，獲得CT值。ΔCT為同一標(biāo)本目的基因（HOXA11）與內(nèi)參基因（GAPDH）CT值之差，即 ΔCT=CT（HOXA11）－CT（GAPDH），ΔΔCT=ΔCT（各組結(jié)直腸癌細(xì)胞）-ΔCT（正常腸黏膜組織）的差值，HOXA11 的相對表達(dá)量以 2－ΔΔCT表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；組間頻數(shù)比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOXA11在結(jié)直腸癌中呈異常甲基化狀態(tài) 采用MSP技術(shù)檢測結(jié)直腸癌和配對正常腸黏膜組織中HOXA11基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化情況，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。89例結(jié)直腸癌患者中共67例癌組織標(biāo)本存在甲基化（75.3%），而正常腸黏膜組織中僅14例存在甲基化（15.7%）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織中HOXA11基因甲基化率顯著高于正常腸黏膜組織（P＜0.01）。

圖1 MSP檢測結(jié)直腸癌組織及配對正常腸黏膜組織中HOXA11啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)（T：結(jié)直腸癌組織；N：正常腸黏膜組織；M：甲基化；U：非甲基化）

2.2 HOXA11基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與其mRNA表達(dá)量的關(guān)系 發(fā)生甲基化的結(jié)直腸癌組織中HOXA11 mRNA的相對表達(dá)量明顯低于較未發(fā)生甲基化的結(jié)直腸癌組織（P＜0.01），見圖 2。

2.3 HOXA11基因啟動(dòng)子甲基化與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中HOXA11基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.01）及TMN分期（P＜0.01）密切相關(guān)，而與患者的年齡、性別、組織分化、浸潤深度無關(guān)（均P＞0.05），見表1。

圖2 結(jié)直腸癌組織中HOXA11甲基化狀態(tài)與其mRNA表達(dá)水平的關(guān)系（**P＜0.01）

表1 HOXA11基因啟動(dòng)子甲基化與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 結(jié)直腸癌細(xì)胞系HOXA11基因啟動(dòng)子甲基化情況MSP結(jié)果顯示，所有結(jié)直腸癌細(xì)胞系中HOXA11啟動(dòng)子均呈高甲基化狀態(tài)。使用20μmol/L甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dC處理細(xì)胞96h后，HOXA11 mRNA相對表達(dá)量均較無5-Aza-dC處理組顯著升高（P＜0.05），見圖3。

3 討論

圖3 5-Aza-dC處理結(jié)直腸癌細(xì)胞系后HOXA11 mRNA表達(dá)水平（*P＜0.05，**P＜0.01）

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是在多種致癌因素作用下，多基因參與、多步驟發(fā)生的過程，主要涉及癌基因的激活和抑癌基因的失活。DNA甲基化異常，特別是癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化，是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一[6]，其中抑癌基因通常由于過度甲基化，導(dǎo)致表觀遺傳學(xué)改變，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，參與惡性腫瘤的進(jìn)展[7]。結(jié)直腸癌中廣泛存在抑癌基因異常甲基化，目前研究認(rèn)為，部分腫瘤相關(guān)基因甲基化是結(jié)直腸癌早期診斷及靶向治療的生物標(biāo)志[8]。因此，深入研究結(jié)直腸癌中的DNA甲基化對于腫瘤診斷和治療具有至關(guān)重要的意義。

同源框基因（homeobox genes，HOX）主要包括 A、B、C、D四個(gè)基因簇，是一類在進(jìn)化上高度保守的基因，主要參與調(diào)控胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化。近期研究表明，HOX基因表達(dá)異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9-10]。HOXA11是HOX基因家族中的一員，位于染色體7p。最新研究結(jié)果表明，卵巢癌[4]、膠質(zhì)瘤[11]、乳腺癌[12]、腎癌[13]、肺癌[14-15]和胃癌[16-17]普遍存在HOXA11異常甲基化，抑制HOXA11基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

為闡明HOXA11在結(jié)直腸癌組織中的甲基化水平及其與患者臨床病理特征間的關(guān)系，本研究采用MSP法對結(jié)直腸癌組織及配對正常腸黏膜組織中HOXA11基因甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，與正常腸黏膜比較，HOXA11基因在結(jié)直腸癌組織中普遍存在異常甲基化。除此之外，結(jié)直腸癌組織中異常甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生甲基化的結(jié)直腸癌組織中HOXA11 mRNA表達(dá)水平顯著低于未甲基化的結(jié)直腸癌組織。基因的異常甲基化會(huì)導(dǎo)致基因的表達(dá)沉默，筆者推測，HOXA11基因異常甲基化可能是導(dǎo)致HOXA11基因低表達(dá)的重要原因之一。為進(jìn)一步驗(yàn)證推測，體外實(shí)驗(yàn)中使用了甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dC，降低細(xì)胞的甲基化水平，結(jié)果提示5-AzadC作用后，6種HOXA11異常甲基化的結(jié)直腸癌細(xì)胞系中HOXA11 mRNA的表達(dá)水平顯著增高，與推測一致。由此可以得出，結(jié)直腸癌組織中HOXA11基因異常甲基化抑制了HOXA11基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中HOXA11基因普遍存在異常甲基化，抑制其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。結(jié)直腸癌中HOXA11基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期的危險(xiǎn)性因素。通過本研究，筆者預(yù)測HOXA11基因甲基化檢測可能是結(jié)直腸癌早期篩查及精準(zhǔn)治療的潛在生物標(biāo)志物。